動物性食品中桿菌肽殘留量測定的前處理方法

桿菌肽的危害及檢測目的

桿菌肽是由一組類似的多肽成分組成的混合物，其中桿菌肽A、B1和B2組分被認為ZJ抗微生物活性。獸醫臨床上常見以桿菌肽鋅和桿菌肽亞甲基水楊酸鹽形式用于畜禽促生長和FZ動物的壞死性腸炎。在歐盟，亞甲基水楊酸桿菌肽還被推薦用于ZL由產氣莢膜梭菌引起的兔壞死性腸炎。桿菌肽KJ譜廣、吸收低，但會帶來神經毒性和腎毒性，還會產生抗藥性風險，是ZL中使用普通抗生素無效的ZH選擇。若該類抗生素通過食物鏈進入人體，會對人體造成健康隱患。因此我國農業農村部和國家市場監督管理總局2019年發布的GB 31650-2019《食品安全國家標準食品中獸藥ZD殘留限量》中明確規定了桿菌肽在動物靶組織中的殘留限量。

本文闡述了如何將桿菌肽從樣品基質中分離提取出來，并經過凈化后，轉化成液質聯用儀可以檢測的形式。以提取、凈化為ZD，依據國標GB/T 20743-2006，為檢測人員和相關領域研究人員提供一定的參考。

檢測項目：桿菌肽

應用范圍：豬肉、豬肝和豬腎

液相色譜-質譜/質譜法

方法原理：試樣中桿菌肽殘留用酸化的甲醇水勻漿提取，經雙硫腙三lv甲烷溶液進行液液分配凈化后，再經固相萃取柱凈化，液相色譜-串聯質譜儀測定，外標法定量。

前處理儀器：

分析天平（感量0.01 g 和0.1 mg）；高速組織搗碎機（10000 r/min）；振蕩器；離心機（4000 r/min）；離心管（10 mL和60 mL具塞）；貯液器（50 mL）；固相萃取真空裝置；氮吹儀；微量注射器（25 μL和100 μL）。

檢測儀器：LC-MS/MS+ESI源

樣品的制備與保存

豬肝臟、腎臟要去除脂肪和其他的非肝臟、腎臟組織，豬肉要去皮和骨頭，將其攪碎拌勻，分出0.5 kg作為試樣，將制備好的試樣密封，并做上標記。試樣置于零下18 ℃條件下保存。

前處理方法

1.提取

稱取10 g試樣（精確到0.01 g ）置于60 mL離心管中，加入0.1 mL甲酸和20 mL甲醇+水（1+1），于高速組織搗碎機上勻漿提取1 min，然后加入20 mL經甲醇+水（1+1）飽和的0.0025 %雙硫腙三lv甲烷溶液，于振蕩器上劇烈振蕩10 min，以4000 r/min離心10 min，取上清液10 mL于50 mL試管中，棄去其余上清液。

往上述雙硫腙三lv甲烷溶液中加入30 mL水，搗碎殘渣，置于振蕩器上劇烈振蕩10 min，移取全部上清液于另一60 mL離心管中。重復提取一次，合并上清液，混勻，以4000 r/min離心10 min，取上清液30 mL與50 mL試管中的提取液合并，混勻。

2.凈化

在預處理過的固相萃取柱（HLB 60 mg/3 mL用3 mL甲醇和3 mL水活化）頂部連接貯液器，移入上述試管中樣液，待樣液全部通過萃取柱后，加入2 mL水，棄去全部流出液。然后，將固相萃取柱在50 kPa～55 kPa的負壓下抽干1 h，ZH用2 mL甲醇洗脫，收集洗脫液于10 mL試管中，洗脫液在35 ℃水浴中用氮氣吹干，用0.5 mL甲醇重新溶解殘渣，再加入0.5 mL 0.3 %甲酸溶液，搖勻后，供液相色譜-串聯質譜儀測定。

國標解讀及注意事項

1.桿菌肽標準物質用0.1 %甲酸甲醇溶液配成濃度為0.1 mg/mL的標準儲備液，在2 ℃～4 ℃保存，有效期3個月。

2.本方法使用酸化甲醇水均質提取，經雙硫腙三lv甲烷液液分配凈化后，再用HLB固相萃取柱凈化，相當于5 g樣品進行上機檢測。

3.桿菌肽易溶于水，在弱酸性條件下穩定，有機相越高回收率越低，使用酸化甲醇水（1+1）提取回收率高但是容易乳化，使用雙硫腙三lv甲烷進行液液分配凈化，離心后可降低乳化程度，使上清液更加清澈。

4.通過兩次水洗雙硫腙三lv甲烷殘渣，不僅可提高目標物的回收率，確保稀釋倍數準確，還可以在合并上清液后降低甲醇比例，為下一步固相萃取凈化做好準備。

5.固相萃取過程中需要控制流速，使溶液一滴一滴地流下，以保證凈化富集的效果。

6.本方法使用基質標準工作溶液進行定量分析，根據具體檢測樣品選取合適的基質制作空白樣品提取液配制基質曲線。

參考文獻

GB/T 20743-2006 豬肉、豬肝和豬腎中桿菌肽殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法

圖1 豬肉、豬肝和豬腎中桿菌肽殘留量測定的前處理流程圖

文章來源：標準物質ZX（https://www.gbw-china.com/)