GB 31658.20-2022 動物性食品中酰胺醇類藥物及其代謝物殘留量的測定液相色譜-串聯質譜法

2023-08-14 12:44:24 1513閱讀次數

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酰胺醇類藥物屬于廣譜抑菌劑，可以通過抑制蛋白質的合成，從而達到抑菌的效果。此類藥物包括氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考，而氟苯尼考胺是氟苯尼考的一種代謝產物。其中氯霉素殘留時間較長，具有很大的毒副作用，可導致動物產生嚴重的再生障礙性貧血這一不良反應，易造成安全風險。因此氯霉素已經被世界衛生組織及許多國家禁止使用在食品動物方面，中國農業部也已將其列為禁藥。而甲砜霉素和氟苯尼考（為甲砜霉素的氟化衍生物）由于不含硝基，不會引起再生障礙性貧血，因此被允許用于食品動物中細菌性疾病的防控治療。根據GB 31650-2019 《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量》要求，甲砜霉素和氟苯尼考每日容許攝入量（ADI）分別為0 μg/kg bw-5 μg/kg bw和0 μg/kg bw-3 μg/kg bw。

針對于GB 31658.20-2022《動物性食品中酰胺醇類藥物及其代謝物殘留量的測定液相色譜-串聯質譜法》，對方法進行優化，采用內標法定量，對不同基質中的酰胺醇類藥物及其代謝物殘留量進行了檢測，驗證方法標準曲線線性良好，回收率高，精密度好。

標準溶液配制

1.1

標準品

表1-1 標準品基本信息

1.2

標準溶液配置：

混合標準中間液（-18℃，3個月）：分別精密量取氯霉素標準儲備液0.05 mL，甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺標準儲備液各0.25 mL，于5 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成氯霉素濃度為1 μg/mL，甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺濃度為5 μg/mL混合標準中間液。

混合標準工作液1（現用現配）：取混合標準中間液0.1 mL，用20%甲醇溶液稀釋成1 mL，氯霉素濃度為100 μg/L，甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺濃度為500 μg/L。

混合標準工作液2（現用現配）：取混合標準工作液1 0.1 mL，用20%甲醇溶液稀釋成1 mL，氯霉素濃度為10 μg/L，甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺濃度為50 μg/L。

混合內標中間液（-18℃，3個月）：分別精密量取氯霉素-D5標準儲備液0.05 mL，甲甲砜霉素-D3、氟苯尼考-D3、氟苯尼考胺-D3標準儲備液各0.25 mL于5 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，配制成氯霉素-D5濃度為1 μg/mL，甲砜霉素-D3、氟苯尼考-D3、氟苯尼考胺-D3濃度為5 μg/mL混合內標中間液。

混合內標工作液（現用現配）：取混合內標中間液0.05 mL，用20%甲醇溶液稀釋成5 mL，氯霉素-D5濃度為10 ng/mL，甲砜霉素-D3、氟苯尼考-D3、氟苯尼考胺-D3濃度為50 ng/mL混合內標工作液。

1.3

標準曲線：

用20%甲醇水溶液稀釋，配制成氯霉素濃度分別為0.2 μg/L、0.5 μg/L、1 μg/L、2 μg/L、5 μg/L、10 μg/L，甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺濃度分別為1 μg/L、2.5 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、25 μg/L、50 μg/L，氯霉素-D5濃度均為1 μg/L，甲砜霉素-D3、氟苯尼考-D3、氟苯尼考胺-D3濃度均為5 μg/L的系列標準溶液，臨用現配，供液相色譜串聯質譜儀測定。以定量離子峰面積比為縱坐標、濃度為橫坐標繪制標準曲線，求回歸方程和相關系數。

表1-2 標準曲線配置信息

前處理操作

2.1

樣品前處理

取試料2g（準確至±0.05g），置于50mL 離心管中，加混合內標工作液100μL,渦旋混勻，再加2%氨化乙酸乙酯（氨水:乙酸乙酯=1:50，v/v）溶液10mL（牛奶樣品需另加無水硫酸鈉3g），渦旋30s，渦旋振蕩10min，8000r/min離心5 min。上清液轉入另一50mL離心管中，殘渣中加2%氨化乙酸乙酯溶液10mL，重復提取一次。合并兩次提取液，于50℃氮氣吹干，待凈化。

取待凈化殘渣，加4%氯化鈉水溶液（w/v）3mL，渦旋使溶解，再加4%氯化鈉飽和的正己烷5mL，渦旋30s，8000r/min離心5min，棄去上層正己烷層，用4%氯化鈉飽和的正己烷重復脫脂一次。加2%氨化乙酸乙酯溶液5mL，渦旋振蕩5min，8000r/min離心5min，取上層有機相。用2%氨化乙酸乙酯溶液5mL重復萃取一次，合并有機相，50 ℃氮氣吹干，加20%甲醇水溶液1mL，渦旋30s。過0.22μm尼龍濾膜（貨號：SCAA-104），供液相色譜-串聯質譜儀測定。

儀器條件

3.1

液相色譜：

a) Athena C18 液相色譜柱（2.1 mm*100 mm，1.8 μm，貨號：LAEQ-2110UA）；

b)柱溫：30℃；

c)流速：0.30 mL/min；

d)進樣量：5 μL；

f)流動相：A 為10 mmol/L甲酸銨水溶液；B為乙腈；梯度洗脫程序見表3-1。

表3-1 梯度洗脫程序

3.2

質譜條件：

a)離子化模式：電噴霧離子源（ESI），正/負離子模式；

b)掃描模式：多反應離子監測（MRM）；

c)離子源溫度：正/負離子模式均為500℃；

d)噴霧電壓：正離子模式時4500V，負離子模式時-4500V；

e)目標化合物監測母離子、子離子、離子化模式和碰撞能見表3-2：

表3-2 目標化合物質譜監測信息

注：*為定量離子

注意事項：

國標中甲砜霉素-D3的定量離子對為357.2>293.0，氟苯尼考-D3的定量離子對為359.2>339.0，因自然界中氯同位素分布的影響，導致外標甲砜霉素和氟苯尼考的碎片離子中也包含這兩個離子對，會導致內標峰面積的增加，因此甲砜霉素-D3和氟苯尼考-D3使用標準中的定量離子對會導致標準曲線的線性較差，影響定量準確性。為解決這個問題，提供以下2種解決方案

① 對甲砜霉素-D3和氟苯尼考-D3的子離子進行篩選，得到了甲砜霉素-D3（357.1>273.0）、氟苯尼考-D3（359.1>188.1）這兩個定量離子對，內標峰面積變化相對平穩，在標準要求的線性范圍內標準曲線相關系數可達到0.995以上。

② 提高內標濃度（均擴大10倍），這樣可縮小外標對內標峰面積的影響，STD1-STD6線性曲線良好，相關系數R2>0.995。

實驗譜圖

圖4-1 混合標準溶液（氯霉素5 μg/L，甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺25 μg/L）譜圖

圖4-2 牛奶基質空白樣品實驗譜圖

圖4-3 牛奶基質加標（氯霉素5 μg/L，甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺25 μg/L）樣品實驗譜圖

圖4-4 雞蛋基質空白樣品實驗譜圖

圖4-5 雞蛋基質加標（氯霉素5 μg/L，甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺25 μg/L）樣品實驗譜圖

圖4-6 豬肉基質空白樣品實驗譜圖

圖4-7 豬肉基質加標（氯霉素5 μg/L，甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺25 μg/L）樣品實驗譜圖

注：豬肝樣品基質中有氟苯尼考檢出（0.18 μg/kg），低于標準中的方法檢出限（<0.5 μg/kg）。

圖4-8 豬肝基質空白樣品實驗譜圖

圖4-9 豬肝基質加標（氯霉素5 μg/L，甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺25 μg/L）樣品實驗譜圖

實驗數據

5.1

標準曲線：

表5-1 酰胺醇類藥物標準曲線

5.2

加標回收率數據：

表5-2 四種基質樣品加標實驗回收率(n=4)

實驗結論

參考《GB 31658.20-2022 動物性食品中酰胺醇類藥物及其代謝物殘留量的測定液相色譜-串聯質譜法》標準，部分內標選用優化后特征離子對替代原標準推薦離子對（甲砜霉素-D3：357.1/273.0，氟苯尼考-D3：359.1/188.1），采用優化后的方法進行檢測。四種目標物的線性范圍內標準曲線線性方程 R2>0.995，線性良好。四種基質的2個水平的加標回收率均在85%-110%之間，回收率良好，RSD<10%，可滿足實驗要求。