孔雀石綠的危害及檢測(cè)目的

       孔雀石綠又稱堿性綠、苯胺綠，屬于合成三苯甲烷類化工染料的一種，具有GX廣譜的殺菌作用，被作為驅(qū)蟲劑、殺蟲劑、防腐劑在水產(chǎn)中使用，可用作治理魚類或魚卵的寄生蟲、真菌或細(xì)菌感染，后曾被廣泛用于預(yù)防與ZL各類水產(chǎn)動(dòng)物的水霉病、鰓霉病和小瓜蟲病。孔雀石綠在其進(jìn)入人體后會(huì)代謝產(chǎn)生隱色孔雀石綠，從20世紀(jì)90年代開始，國(guó)內(nèi)外學(xué)者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物隱色孔雀石綠具有高毒、高殘留、高致癌、高致畸、致突變等副作用。鑒于孔雀石綠的危害性，許多國(guó)家都將其列為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥物。2020年我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號(hào)，也將孔雀石綠列入《食品動(dòng)物中禁止使用的藥品及其他化合物清單》中。孔雀石綠是我國(guó)主要打擊的濫用食品添加劑和違法添加非食用物質(zhì)之一。

       本文闡述了如何將孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物從樣品基質(zhì)中分離提取出來(lái)，并經(jīng)過(guò)凈化后，轉(zhuǎn)化成液質(zhì)聯(lián)用儀或GX液相色譜儀可以檢測(cè)的形式。以提取、凈化為ZD，依據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T 19857-2005，為檢測(cè)人員和相關(guān)領(lǐng)域研究人員提供一定的參考。

檢測(cè)項(xiàng)目

       孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫

應(yīng)用范圍

       食品/水產(chǎn)品/鮮活水產(chǎn)品及其制品

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

方法原理

       試樣中的殘留物用乙腈-乙酸銨緩沖溶液提取，乙腈再次提取后，液液分配到二氯甲烷層，經(jīng)中性氧化鋁和陽(yáng)離子固相萃取柱凈化后用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。

前處理儀器

       勻漿機(jī)；離心機(jī)（4000 r/min）；超聲波水浴；旋渦振蕩器；KD濃縮瓶（25 mL）；固相萃取裝置；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

檢測(cè)儀器

       HPLC-MS/MS+ESI源

前處理方法

提取

鮮活水產(chǎn)品

       稱取5.00 g已搗碎樣品于50 mL離心管中，加入200 μL混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入11 mL乙腈，超聲波振蕩提取2 min，8000 r/min勻漿提取30 s，4000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至25 mL比色管中；另取一50 mL離心管加入11 mL乙腈，洗滌勻漿刀頭10 s，洗滌液移入前一離心管中，用玻璃棒搗碎離心管中的沉淀，旋渦混勻器上振蕩30 s，超聲波振蕩5 min，4000 r/min離心5 min，上清液合并至25 mL比色管中，用乙腈定容至25.0 mL，搖勻備用。

加工水產(chǎn)品

       稱取5.00 g已搗碎樣品于100 mL離心管中，加入200 μL 混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次加入1 mL鹽酸羥胺、2 mL對(duì)-甲苯磺酸、2 mL乙酸銨緩沖溶液和40 mL乙腈，10000 r/min勻漿2 min，3000 r/min離心3 min，將上清液轉(zhuǎn)移到250 mL分液漏斗中，用20 mL乙腈重復(fù)提取殘?jiān)淮危喜⑸锨逡骸Ｓ诜忠郝┒分屑尤?0 mL二氯甲烷、35 mL水，振搖2 min，靜置分層，收集下層有機(jī)層于150 mL梨形瓶中，再用20 mL二氯甲烷萃取一次，合并二氯甲烷層，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干。

凈化

鮮活水產(chǎn)品

       移取5.00 mL樣品溶液加至已活化的中性氧化鋁柱上，用KD濃縮瓶接收流出液，4 mL乙腈洗滌中性氧化鋁柱，收集全部流出液，45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約1 mL，殘液用乙腈定容至1.00 mL，超聲波振蕩5 min，加入1.0 mL 5mmol/L乙酸銨，超聲波振蕩1 min，樣液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

加工水產(chǎn)品

       將已活化的中性氧化鋁柱串接在已活化的陽(yáng)離子交換柱上方。用6 mL乙腈分三次（每次2 mL），渦旋溶解梨形瓶中提取物，并依次過(guò)柱，控制陽(yáng)離子交換柱流速不超過(guò)0.6 mL/min，再用2 mL乙腈淋洗中性氧化鋁柱后，棄去中性氧化鋁柱。依次用3 mL體積分?jǐn)?shù)為2 %的甲酸溶液、3 mL乙腈淋洗陽(yáng)離子交換柱，棄去流出液。用4 mL體積分?jǐn)?shù)為5 %的乙酸銨甲醇溶液洗脫，洗脫流速為1 mL/min，用10 mL刻度試管收集洗脫液，用水定容至10.0 mL，樣液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

GX液相色譜法

方法原理

       試樣中的殘留物用乙腈-乙酸鹽緩沖混合液提取，乙腈再次提取后，液液分配到二氯甲烷層并濃縮，經(jīng)酸性氧化鋁固相萃取柱凈化后，GX液相色譜-二氧化鉛柱后衍生測(cè)定，外標(biāo)法定量。

前處理儀器

       勻漿機(jī)；離心機(jī)（4000 r/min）；固相萃取裝置；25 %二氧化鉛氧化柱：不銹鋼預(yù)柱管 [5 cm×4 mm（內(nèi)徑）]，兩端附2 μm過(guò)濾板，抽真空下，填裝含有25 %二氧化鉛的硅藻土，添加數(shù)滴甲醇?jí)簩?shí)，旋緊。臨用前用甲醇沖洗。并將二氧化鉛氧化柱連接在紫外-可見光檢測(cè)器與液相色譜柱之間。

檢測(cè)儀器

       HPLC+UV-VIS

前處理方法

提取

       稱取5.00 g樣品于50 mL離心管中，加入1.5 mL 20 %鹽酸羥胺溶液、2.5 mL 1.0 mol/L對(duì)-甲苯磺酸溶液、5.0 mL乙酸鹽緩沖溶液，用勻漿機(jī)以10000 r/min的速度均質(zhì)30 s，加入10 mL乙腈劇烈震搖30 s。加入5 g酸性氧化鋁，再次震蕩30 s。3000 r/min離心10 min。把上清液轉(zhuǎn)移至裝有10 mL水和2 mL二甘醇的100 mL離心管中。然后在50 mL離心管中加入10 mL乙腈，重復(fù)上述操作，合并乙腈層。

凈化

       在離心管中加入15 mL二氯甲烷，振蕩10 s，3000 r/min離心10 min，將二氯甲烷層轉(zhuǎn)移至100 mL梨形瓶中，再用5 mL乙腈、10 mL二氯甲烷重復(fù)上述操作一次，合并二氯甲烷層于100 mL梨形瓶中。45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約1 mL，用2.5 mL乙腈溶解殘?jiān)?/p>

       將已活化的酸性氧化鋁柱安裝在固相萃取裝置上，將梨形瓶中的溶液轉(zhuǎn)移到柱上，再用乙腈洗滌瓶?jī)纱危看?.5 mL，把洗滌液依次通過(guò)柱，控制流速不超過(guò)0.6 mL/min，收集全部流出液，45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，殘液準(zhǔn)確用0.5 mL乙腈溶解，過(guò)0.45 μm濾膜，濾液供液相色譜測(cè)定。

注意事項(xiàng)

       1.該國(guó)標(biāo)方法分為兩部分，第 一部分是液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)法，又分為鮮活水產(chǎn)品提取凈化方法和加工水產(chǎn)品提取凈化方法；第二部分是GX液相色譜檢測(cè)法，只有一種提取凈化方法。

       2.第 一部分液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的檢測(cè)限均為0.5 μg/kg；第二部分GX液相色譜法的檢測(cè)限均為2.0 μg/kg。

       3.在檢測(cè)過(guò)程中，使用黑色Mark筆標(biāo)記樣品容器，非常容易導(dǎo)致結(jié)晶紫殘留，污染樣品。建議使用新的離心管、新的進(jìn)樣瓶等一次性提取容器；建議使用紅色Mark筆替代黑色Mark筆進(jìn)行標(biāo)記。玻璃器皿如果重復(fù)使用，建議洗干凈后用乙腈再洗滌一遍。

       4.該國(guó)標(biāo)方法中液質(zhì)檢測(cè)使用同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。分別為氘代孔雀石綠（MG-D5）和氘代隱色孔雀石綠（LMG-D6）。建議配合氘代結(jié)晶紫（CV-D6）和氘代隱色結(jié)晶紫（LCV-D6）一起使用。

       5.該國(guó)標(biāo)前處理過(guò)程比較復(fù)雜，涉及樣品提取液部分凈化，串接固相萃取柱凈化，二次定容等步驟，注意稀釋倍數(shù)，準(zhǔn)確計(jì)算結(jié)果。

參考文獻(xiàn)

       GB/T 19857-2005 水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定

鮮活水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量液質(zhì)測(cè)定的前處理流程圖

加工水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量液質(zhì)測(cè)定的前處理流程圖

水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量液相測(cè)定的前處理流程圖

孔雀石綠和結(jié)晶紫信息表

壇墨質(zhì)檢對(duì)應(yīng)相關(guān)標(biāo)物

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