Isolation of the (6,5) single-wall carbon nanotube enantiomers by surfactant-assisted aqueous two-phase extraction

表面活性劑輔助雙水相萃取 (6,5)單壁碳納米管對映異構體

發表日期：29 December 2022

DOI：https://doi.org/10.1016/j.carbon.2022.12.071

摘要：

分選單手性對映異構體是單壁碳納米管(SWCNT)純化的最終目標。在本研究中，我們采用雙水相萃取(ATPE)以有限的實驗步驟獲得高純度(>80%)左旋和右旋(6,5)手性SWCNTs。我們總結了優化后的表面活性劑條件，并利用分析型超速離心機(AUC)和近紅外光致發光(PL)測定了分離所需的表面活性劑包裝和分配系數變化條件(PCCCs)。我們的研究為表面活性劑輔助SWCNTs分離背后的潛在機制提供了有價值的新觀點，將會促進了SWCNTs對映異構體在未來的基礎研究和應用中的使用。

目的：對不同表面活性劑中納米管的密度進行測量。

儀器型號：Optima XL-I , An-50 Ti 轉子

左圖：代表性的10.0 g/L DOC中 R-(6,5) SWCNTs樣品在20.0°C水中沉降的擬合曲線和擬合結果。在不同溶液介質密度下測量SWCNT沉降速度，通過中間的公式，得到不同情況條件下的右圖ηS縱坐標數值。

右圖：在恒定的DOC10 g/L(1%)條件下，分別像水中添加D2O或碘克沙醇來調整溶液的密度，來測定不同溶液密度條件下的沉降數據，并做圖。當截距為零時，ρSWCNT = ρs。

實驗條件：

使用標準12 mm光程中心件和藍寶石窗口。在溫度平衡至少2小時后，在20.0℃下，2932 rad/s (28，000 RPM)離心轉速，根據樣品濃度的不同，選擇吸光度波長為306 nm或572 nm。使用密度粘度計分別測量10.0 g/L DOC在水中、100%(標稱)D2O和碘克沙醇(作60%質量/體積的水溶液)混合物中的密度和粘度。中間濃度采用標準曲線取值法。使用SEDFIT軟件，c(s)模型對數據進行擬合。沉降系數(s)分布范圍為0 ~ 20S，分辨率為401，置信區間為0.95。對每個實驗的半月板和噪聲都進行擬合，微分比容參考以前的文獻。

REFERENCE

P. Schuck, Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and lamm equation modeling, Biophys. J. 78 (3) (2000)1606–1619.

P.H. Brown, A. Balbo, H. Zhao, C. Ebel, P. Schuck, Density contrast sedimentation velocity for the determination of protein partial-specific volumes, PLoS One 6 (10) (2011), e26221.

J.A. Fagan, M. Zheng, V. Rastogi, J.R. Simpson, C.Y. Khripin, C.A. Silvera Batista, A.R. Hight Walker, Analyzing surfactant structures on length and chirality resolved (6, 5) single-wall carbon nanotubes by analytical ultracentrifugation, ACS Nano 7 (4) (2013) 3373–3387

Autonomous Synthesis of Functional, Permanently Phosphorylated Proteins for Defining the Interactome of Monomeric 14-3-3ζ

自主合成功能性、永 久磷酸化蛋白，對單體 14-3-3ζ 的相互作用

發表日期：10 April 2023

DOI:https://doi.org/10.1021/acscentsci.3c00191

摘要：

在人體中，超過75%的蛋白質在一個或多個位點被可逆磷酸化，其中近80%是磷酸絲氨酸（pSer）修飾。一個調節磷酸蛋白功能的重要真核生物蛋白質家族被稱為14-3-3，其中14-3-3蛋白質的七種異構體存在于人體中（用希臘字母β、γ、ε、ζ、η、θ、σ表示），并且都是天然二聚體。當在特定序列基序內的絲氨酸/蘇氨酸位點被磷酸化時，它們作為結合數百種蛋白質的中心樞紐，作為調節蛋白活性、細胞定位和與其他蛋白質相互作用能力的一種手段。盡管14-3-3蛋白質一直是深入研究的主題，由于難以制備14-3-3/磷酸蛋白復合物，研究它們調節功能的分子機制仍然是一個挑戰、除此之外，14-3-3本身還受到許多翻譯后修飾（PTM）的影響，這些修飾被認為對調節14-3-3功能很重要，包括至少20個磷酸化位點。

為了了解這些磷酸化的14-3-3ζ單體（在Ser58處含有nhpSer）的生物學功能，本文從HEK293T裂解物中分離出其相互作用組，并將其與野生型14-3-3ξ的相互作用組進行比較，發現14-3-3ζ與一種具有藥理學意義的E3泛素連接酶銜接蛋白cereblon相互作用的是單體，而不是二聚體。

目的：研究14-3-3ζ單體與pSer 16及nhpSer 16的相互作用

型號：Optima XL-A，An-60-ti

實驗數據：

（A）pSer16-和（B）nhpSer16-HSPB6/14-3-3復合物在14.3μM濃度（左）、7.2μM（中）和3.6μM（右）下在15k（紅色）、10k（綠色）和8k（藍色）rpm下的沉降平衡數據。將平衡數據擬合到兩態a+B<-->AB模型，其中pSer和nhpSer復合物的離解常數分別為92±13和120±26nM（置信區間95%）

實驗結果：

本文通過將一種由磷酸烯醇式丙酮酸鹽產生nhpSer的六步生物合成途徑改造到大腸桿菌中，使該系統提高了40倍。使用這種自主的“PermaPhos”表達系統，用nhpSer產生了三種生物相關蛋白，并證實nhpSer模擬磷酸絲氨酸對激活嚴重急性呼吸系統綜合征冠狀病毒2型核衣殼蛋白的GSK3β磷酸化、促進14-3-3/端復合和單體化14-3-3二聚體的作用。

AUC實驗條件：

• 儀器型號：Optima XL-A

• 轉頭型號：An-60-ti

• 分別配置三個梯度的蛋白樣品：OD280=1.0 (14.3 μM), 0.5 (7.2 μM), and 0.25 (3.6 μM)

• 緩沖液：50 mM Tris， pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP

• 使用SENDTERP計算蛋白偏微分比容，緩沖液密度，粘度

• 轉速設置：8,000, 10,000, 15,000 rpm

• 溫度：5 °C.

• 方法：每3小時進行一次280nm波長的掃描，以檢查是否達到了平衡，在達到轉速后至少30小時進行最 終掃描。數據適用于簡單的異二聚模型（a+B? AB），HSPB6二聚體的固定質量為33031Da，14-3-3ζ二聚體為52395Da。在AUC實驗前后，將蛋白質裝載在SDS-PAGE和Phos標簽凝膠上，以確認在數據采集過程中保持了樣品的完整性。通過非配對雙尾t檢驗（p=0.05）比較含有pSer和nhpSer的復合物的計算ln-Ka值，以確定統計學顯著性。

REFERENCE

Zhu, P., Stanisheuski, S., Franklin, R., Vogel, A., Vesely, C. H., Reardon, P., & Cooley, R. B. (2023). Autonomous Synthesis of Functional, Permanently Phosphorylated Proteins for Defining the Interactome of Monomeric 14-3-3ζ. ACS Central Science, 9(4), 816-835.

Rapid high-resolution size distribution analysis for adeno-associated virus using high speed SV-AUC

基于高速 SV-AUC 對腺相關病毒進行快速高分辨率大小分布分析

發表日期：10 May 2023

DOI:https://doi.org/10.1101/2023.05.08.539919

摘要：

經過優化后，沉降速度分析超速離心 (SV-AUC) 可提供所有方法中最準確、范圍最廣和分辨率最 高的粒度分布分析。為腺相關病毒 (AAV) 樣本生成擬合數據，該樣本由僅 DNA 含量不同且沉降系數相近的四種顆粒組成，允許操作 SV-AUC 實驗方案以優化尺寸分布分辨率。在開發這種高速 SV-AUC (hs-SV-AUC) 方案時，必須克服幾個實驗挑戰：

1. 快速數據采集的需要

2. 避免陡峭邊界的光學偽影

3. 克服對流風險的增加 

已經開發出一種名為 hs-SV-AUC 的方案，該方案利用高轉子速度、干涉檢測和低溫來克服這些挑戰。通過將數據分析限制在有限的徑向時間窗口內并使用非常短的運行時間（溫度平衡后 < 20 分鐘），樣品和參比溶劑需要一致，彎液面位置勾選，從而使干涉檢測器用作吸光度檢測變得簡單。hs-SV-AUC 在 45K rpm 和10°C 下對同一AAV 樣品進行的實驗尺寸分布與低速 SV-AUC 在 15K rpm 和 10 °C 下的實驗尺寸分布說明了 hs-SV-AUC方案提供了改進的尺寸分布分辨率 。

型號：Beckman Coulter Optima分析超速離心機

“A”和“B”中的重疊 AAV c(s) 與 S 分布圖均是從在不同日期以 15K rpm 和 10 °C 進行的兩次單獨的 SV-AUC 實驗運行中獲得的。圖6中使用的AAV樣品采用吸光度、OD230nm、（淺藍色）和干擾（黑色）檢測。對于每次運行，兩個檢測器的 AAV c(s) 與 S 分布圖均以面積歸一化疊加圖形式提供（干擾數據歸一化為吸光度數據）

AUC實驗條件：

所有運行均使用 10 °C 下的 An-60 Ti 4 孔轉子和 12 mm Epon 中心件。AAV 實驗在 15K rpm（標準 SV-AUC）或 45K rpm（hs-SV-AUC）下進行，而溶劑實驗僅在 45K rpm（hs SV-AUC）下進行。

REFERENCE

Steven A. Berkowitz, Nicholas Larson, George Bou-Assaf, Thomas Laue.Rapid high-resolution size distribution analysis for adeno-associated virus using high speed SV-AUC. bioRxiv 2023.05.08.539919