9月8日的貝克曼庫爾特生命科學AUC分析超速離心技術應用交流會已圓滿落幕。本屆AUC應用交流會圍繞病毒載體表征及蛋白質(zhì)研究等熱門應用話題，重 點關注結(jié)構(gòu)生物學及基因治 療行業(yè)的發(fā)展及技術趨勢。會上我們有幸邀請到來自清華大學、廈門大學、派真生物、九天生物等科研及工業(yè)領域的專家共同分享AUC應用及技術經(jīng)驗。會中收到了大家的踴躍提問，我們精選了一些問題與答案，希望能夠幫助您不斷了解AUC技術趨勢并開拓各種新的重要應用，加速新的科學發(fā)現(xiàn)。

請問SE和SV兩種模式怎么選擇？

首 選SV，速度快，SV是目前最常用的實驗方法，對于自聚集KD值相關研究建議選擇SE。

測定Kd值最 好是用SE嗎？

自聚集KD值研究首 選SE。

請問測二聚體蛋白自身KD需要怎么做呢？

可參考李文奇老師近期文章：《沉降速率法研究蛋白質(zhì)自聚集》。

2.AUC數(shù)據(jù)分析相關內(nèi)容：

請問AUC檢測相同的抗體樣品，復孔之間有差異，原因可能是什么？

注意操作細節(jié)及cell alignment。可參考最近發(fā)表的一篇文章：Best Practices for Aggregate Quantitation of Antibody Therapeutics by Sedimentation Velocity Analytical Ultracentrifugation。

請問 AUC用于AAV樣品實心率檢測的精密度怎么樣？同一樣品不同時間檢測？

RSD 5%以內(nèi)。

f/f0的意義？

蛋白質(zhì)在溶液中的摩擦系數(shù)為f，而對于理想的非水化的剛性球體的摩擦系數(shù)為f0。摩擦系數(shù)和軸長比是相關的，根據(jù)f/f0比值，可以推算蛋白的形狀是什么樣的，若f/f0接近于1的樣品，表明其形狀接近圓球形；如蛋白分子為線性結(jié)構(gòu)，則f/f0比值會遠大于1，如膠原蛋白f/f0比值大于 2。

3、AUC實驗細節(jié)：

如何確定AAV檢測合適的轉(zhuǎn)速？

AUC的轉(zhuǎn)速高低會對表征精度產(chǎn)生影響，需要在AUC分離精度和數(shù)據(jù)采集二者進行權衡，即既能達到理想的分離精度，又能采集足夠的數(shù)據(jù)。通常建議在研發(fā)的早期使用較高的轉(zhuǎn)速進行實驗，研究包括empty、partial、full及aggregate等各個組分情況，后續(xù)工藝穩(wěn)定后，可根據(jù)實際情況選擇較低一點的轉(zhuǎn)速。

請問貴公司AAV吸收波長定為A230，有什么依據(jù)嗎？

使用230nm進行AAV空殼率檢測，無需后續(xù)的矯正。而使用260nm和280nm則需要進行矯正。詳見下述參考文獻的附件內(nèi)容：Comprehensive Size Distribution and Composition Analysis of Adeno-Associated Virus Vector by Multiwavelength Sedimentation Velocity Analytical Ultracentrifugation。

想問一個數(shù)據(jù)處理的問題。f/f0是檢測之后，軟件擬合出來的結(jié)果，還是在擬合前參數(shù)設置時輸入的數(shù)值？為什么參數(shù)設置時輸入了一個f/f0的數(shù)值，勾選后，擬合結(jié)果顯示的f/f0數(shù)值與設置的數(shù)值不一樣呢？但設置了f/f0數(shù)值，不勾選時，擬合后的f/f0結(jié)果和設置時就是一樣的。那么在處理數(shù)據(jù)時該不該勾選呢？

使用sedfit軟件進行數(shù)據(jù)處理的時候有兩種模式，run模式和fit模式，fit模式更精確，耗時更長。如果在fit模式下勾選了f/f0，軟件會自己擬合一個合適的數(shù)值，所以fit后f/f0會變?yōu)檐浖M合的數(shù)值。如果沒有勾選，軟件按照你所輸入的數(shù)值進行擬合，擬合后輸出的結(jié)果就是你輸入的數(shù)值。

buffer吸收太高的話，可以用水替代嗎？

不可以，建議換液。

請問部分AAV峰有多個且和實心AAV峰沒有明顯的區(qū)分，這種情況下是否有辦法對某一個峰進行鑒別？

自聚集KD值研究首 選SE。

4.AUC應用問題：

AUC可以區(qū)分細胞膜蛋白的聚集狀態(tài)嗎？單體、二聚體、四聚體或者寡聚狀態(tài)？這其中需要注意什么？

AUC可以區(qū)分膜蛋白聚集體的狀態(tài)，SV的方法可以進行有效區(qū)分，需要注意去垢劑的量，其對膜蛋白聚集狀態(tài)有一定影響。如果要得到準確的數(shù)值需要使用SE法。

請問AUC可以分析囊泡型中性脂質(zhì)體佐劑或水包油乳劑佐劑與抗原的相互作用么？

可以進行嘗試。

DCE-AUC是一種分析方法了嗎？CsCl沒有光譜吸收嗎？需要的樣品量是多少？

是的。CsCl在260,280及230nm處沒有光吸收。所需的樣品量僅為8×e10  vp/mL（若滴度8×e12  vp/mL AAV樣品在230nm處吸收值為1OD）。

DGE-AUC，還可以用在哪些領域？

AAV，腺病毒以及其他的溶瘤病毒等眾多領域。

5.AUC與其他正交方法：

AUC與SEC在分析蛋白藥物聚體中哪一個更受法規(guī)青睞呢？是否需要兩個都做？做正交驗證？

二者皆為FDA推薦的方法，AUC的分析精度更高，更接近天然狀態(tài)。建議有條件二者都做，特別是要進行中美雙報。

AUC、SEC-MALS、mass photometry檢測空殼率哪一個更好？

目前AUC是大家最公認的檢測方式。后兩種方法同樣有各種的優(yōu)點及缺點。

以上就是AUC應用交流會常見問題Q&A，希望對大家有所幫忙。

在未來，我們相信AUC技術將在各種學科領域有著不可限量的發(fā)展空間。