可靠    創新    同行    發展

要點
?利用脂質納米顆粒（LNPs）在COVID疫苗中的突破性成功為RNA療法打開了一扇窗口。
?LNP的組分和物理性質在核酸穩定性、封裝和轉染效率方面起著作用。
?不同的LNP生產工藝各有其優點，相關研究致力于對其進行改進。
?對LNPs的前期和臨床研究為它們在各種疾病中的應用鋪平了道路。

核酸療法是一種廣泛應用于多種疾病的常見治療方法。脂質納米粒(LNPs)是具有RNA穩定性、強轉染效率、可調節的藥代動力學、有限毒性和已證實的可轉化性的有前途的遞送載體。在這篇綜述文章中，我們介紹了基于脂質的遞送系統，重點介紹脂質納米粒，并闡述了其應用的必要性，對每個組件進行了全面分析，并突出了現有制造工藝的優缺點。我們還總結了正在進行和已完成的使用LNPs的臨床試驗，指出值得研究的重要方面/問題，并分析了這一具有重大意義和前景的治療方法的未來前景。

1. 引言
核酸作為一種治療手段，在包括癌癥及免疫治療等眾多疾病的治療中頗受青睞，且關注度與日俱增。作為生命的基本組成部分，核酸為從根本上針對疾病（如癌癥）提供了獨特機遇。然而，基于核酸的治療方法在成功實現這些分子的有效遞送方面存在一些挑戰。若未提供充分保護，核酸在人體內不穩定，且若無額外協助無法穿透細胞膜。納米技術的出現為這些問題提供了解決方案，這并不令人意外。在這篇綜述論文中，我們聚焦于在臨床前和臨床研究中使用，并已應用于患者 RNA 遞送治療的最突出的遞送載體之一——脂質納米粒（LNPs）。我們嘗試總結 LNP 制劑的一些最為重要的觀點，以及與這些粒子相關的潛在優勢或缺陷。

1.1. RNA 療法的歷史背景
2003 年人類基因組計劃完成后，基因測序技術取得了顯著進步，加深了我們對不同疾病遺傳成因的理解，為 RNA 療法的發展鋪平了道路，其能夠針對傳統藥物、小分子或基于蛋白質的藥物無法靶向的疾病相關基因。RNA 療法涵蓋針對蛋白質表達的不同細胞機制，包括利用信使 RNA（mRNA）和非編碼 RNA，如小干擾 RNA（siRNA）、微小 RNA（miRNA）、反義寡核苷酸（ASO）以及 RNA 適體，通過 RNA 干擾（RNAi）促進或抑制所需基因的表達。ASO 為單鏈寡核苷酸，與靶標 RNA 有 18 - 30 個堿基對互補，它們與之結合并通過 RNA 酶 H 介導的 mRNA 鏈水解或空間位阻阻礙翻譯。基于 ASO 的藥物，如 nusinersen、eteplirsen 和 inotersen，已獲批用于治療脊髓性肌萎縮癥、杜氏肌營養不良癥和家族性淀粉樣多神經病。Pegaptanib 是一種經化學修飾的 RNA 適體，能夠特異性識別并結合血管內皮生長因子（VEGF）以抑制血管生成。它已被批準用于年齡相關性黃斑變性（AMD）的臨床應用。siRNA 是 20 - 25 個堿基對長度的雙鏈 RNA 分子。這些分子在靶向 mRNA 鏈時具有高度特異性，通過 RNA 誘導沉默復合物（RISC）和細胞的 RNAi 機制誘導轉錄后基因沉默。在不同的 siRNA 療法中，patisiran 是首個獲得 FDA 批準用于治療遺傳性淀粉樣變性轉甲狀腺素蛋白淀粉樣變性的 siRNA 藥物，其后還有 givosiran、lumasiran 和 inclisiran。

盡管基于miRNA的治療方法尚未獲得FDA的批準，但一些產品，如cobomarsen和remlarsen，正在進行臨床試驗。總的來說，基于miRNA的治療方法可以成為有前途的工具，因為它們可以模仿或抑制miRNA。最后，基于mRNA的疫苗最近被用于對抗COVID-19，利用mRNA來誘導SARS-CoV-2刺突蛋白的表達，最終被身體的免疫細胞檢測到以保護免受疾病侵害。這些基于mRNA的疫苗的發展也為使用mRNA為基礎的治療方法治療非傳染性疾病開辟了新的途徑。

1.2. RNA遞送的挑戰
針對遺傳易感疾病（如遺傳性載脂蛋白A5介導淀粉樣變性多發性神經病（帕提薩蘭）、急性肝卟啉癥（吉沃西蘭）、原發性高草酸尿癥（盧馬西蘭）和原發性高脂血癥（英克西蘭））的RNA基療法的整合似乎很有前景，并可能帶來潛在的治療方法。然而，RNA基療法的安全有效遞送極具挑戰性。例如，RNA分子的大小（ASOs、siRNAs或mRNAs的大小從幾千道爾頓到幾百千道爾頓不等）和核酸構件的負電荷是這些分子難以穿過帶負電荷的細胞膜的重大障礙。此外，盡管未修飾的核酸可以被內吞體攝取，但將其釋放到細胞質中是不可行的，最終會導致其降解;
這一點至關重要，因為基于RNA的分子必須到達細胞質才能發揮作用。RNA及其給藥的另一個障礙是，RNA在體液中的核酸酶迅速降解。外源性RNA遞送應避免通過Toll樣受體（TLR）和視黃酸誘導基因I（RIG-I）介導的固有免疫系統反應，因為這些受體可以識別遞送的RNA并觸發免疫反應，從而降低其翻譯能力。簡而言之，在將RNA分子作為藥物使用時，需要考慮其生物利用度、消除和降解、靶向區域的生物分布、腎臟清除、進入細胞成分的吸收以及內吞作用進入細胞質的逃逸。

因此，人們在開發和研究適當的遞送系統方面投入了大量精力，以確保在將未修飾的RNA分子輸送到目標區域時，能夠最大程度地減少毒性和免疫原性。此外，遞送系統應能夠促進通過內吞作用進入細胞后從內體中逃逸。這帶來了重大挑戰，因為治療性藥物需要逃離這種降解途徑才能保持有效性。在這篇綜述文章中，我們將重點介紹脂質納米顆粒，并介紹其配方中的不同因素以及它們如何影響載體的最終特性。

2. 闡述預期結果：核酸的循環與內吞體逃逸
RNA 遞送所面臨的生理屏障可分為細胞外和細胞內兩類。裝載核酸的載體必須保護其所載內容在血漿中不被降解，而載體自身在抵達靶向細胞前應避免被單核吞噬系統（MPS）察覺和吞噬。經內吞作用（圖 1）被細胞攝取后，納米顆粒所處的環境會在內體成熟過程中出現 pH 值下降，可低至 pH 4 - 5 左右。納米顆粒需具備特定特性才能從內體中逃逸。例如，基因遞送中最常用的納米顆粒依賴于帶正電的分子，如胺類，當 pH 值低于其 pKa 時，這些胺基團會引發質子化。即使是不依賴胺類的納米顆粒，如聚（乳酸 - 共 - 乙醇酸）（PLGA）聚合物，在 pH 值變化時也會因粒子表面的選擇性逆轉而發生內體逃逸。這些特性導致質子和反離子的積聚，促使細胞質中的液體流向內體。這種滲透驅動現象導致內體膨脹和膜不穩定，在某些情況下，帶正電的納米顆粒與帶負電的膜雙層之間的靜電相互作用或與內體膜的融合會使情況更加復雜。最終，這會致使內體破裂，將納米顆粒及其所攜帶的核酸釋放到細胞質中。在細胞質較高的 pH 值環境下，納米顆粒與核酸之間的結合作用減弱，最終促使封裝的分子得以釋放。

圖1. 攜帶脂質納米顆粒的核酸進入細胞質以調節基因表達的細胞攝取和內吞逃逸過程。

3. RNA 治療的遞送系統
在過去幾十年中，為應對上述高效 RNA 遞送所面臨的挑戰，基于病毒和非病毒載體的不同遞送載體已得到探索。例如，病毒載體能夠自然且高效地將遺傳物質遞送至宿主細胞。而且，它們能夠展現短期和長期的轉基因表達能力。各種各樣的病毒載體已被應用于臨床，包括腺病毒、腺相關病毒、單純皰疹病毒、逆轉錄病毒和慢病毒，用于體內或體外基因治療，其中逆轉錄病毒和慢病毒載體被用于遞送基于 RNA 的有效載荷。然而，病毒載體介導的遞送可能引發的潛在炎癥反應、免疫原性以及宿主細胞的誘變是顯著的缺陷。

相反，開發非病毒載體旨在潛在地降低病毒載體所引發的免疫原性副作用。然而，鑒于病毒載體和非病毒載體均有其優勢和劣勢，輸送系統的選擇取決于治療目標和宿主的安全性。用于 RNA 輸送的不同類型非病毒納米載體已得到探索，涵蓋聚合物納米顆粒、脂質納米顆粒、無機納米顆粒、混合載體系統（即由脂質、聚合物和/或無機材料組合而成的納米顆粒，例如聚合物 - 脂質雜化或無機 - 有機雜化納米顆粒）以及仿生納米顆粒。在此，在當前針對 RNA 輸送所研究的不同載體中，我們聚焦于脂質納米顆粒，這一輸送系統類別與已應用于患者護理的產品相關，并在近年來備受矚目。

3.1. 基于脂質的系統 - 引言
首先，必須承認用于核酸遞送的基于脂質的系統存在不同類型，并且這些載體能夠被制備成納米尺寸。例如，基于脂質的載體包括脂質體、脂質納米顆粒、固體脂質納米顆粒（包含納米結構脂質載體）和納米乳液（圖 2），由于基于脂質的載體所共有的特性，它們已成為 RNA 遞送的寶貴工具。這些特性涵蓋生物相容性、多功能性、易于改性和規模生產、因與細胞膜結構相似而產生的強內化作用，以及與病毒載體相比潛在的免疫反應減弱。實際上，用于某一類型基于脂質的納米載體的脂質也常常被用于配制其他類型。例如，DSPC 這種常用于脂質體的脂質，也經常被用于脂質納米顆粒的配制。另一方面，不同組別的特定配方、物理特性和脂質差異是導致不同分類的原因。在聚焦于脂質納米顆粒之前，我們簡要描述具有代表性的基于脂質的制劑。

圖 2. 用于核酸遞送的脂質基系統示意圖。

3.2. 脂質體（Liposomes）
脂質體是由脂質雙層圍繞單個或多個水相核心自組裝形成的球形囊泡。亞微米級（即直徑小于 200 納米）的脂質體，例如小單層囊泡和大單層囊泡，通常用于藥物遞送應用。事實上，目前有超過 15 種獲批的基于脂質體的藥物制劑，但并非用于核酸。脂質體的一種“變體”，即陽離子脂質體，利用帶正電荷的脂質或分子，這些正電荷分子能夠通過靜電相互作用與帶負電荷的核酸結合。在他們的研究中，Albakr 等人開發了一種用于 miR-1296 的脂質體遞送系統，使 MDA-MB-231 細胞對順鉑治療更敏感。盡管陽離子脂質體在核酸遞送方面具有良好的前景，但永久帶正電荷的陽離子脂質體產生了一些不良后果，如毒性、聚集、穩定性差以及迅速從血液循環中清除等。

3.3. 固體脂質納米顆粒（Solid Lipid Nanoparticles，SLNs）
SLNs 是由生理脂質（如甘油三酯、脂肪酸和蠟）組成的膠體載體，分散于水溶液中，并由表面活性劑穩定，其粒徑在 50 至 1000 納米之間。它們可能呈現均質基質結構、藥物富集外殼結構或藥物富集核心結構。SLNs 在制備方法和有機溶劑的使用方面與脂質體、納米乳液和聚合物納米顆粒有所不同。基于 DOTAP 和 DODAP 的 SLNs 已被用于 DNA 和 RNA 的遞送，并且 DOTAP SLNs 表現出更優的長期穩定性。由于 RNA 與脂質的靜電相互作用主要發生在 SLNs 水相與脂質相的表面，將帶負電荷的親水性 RNA 適當地封裝在親脂性核心基質內具有一定難度，這限制了 SLNs 的應用。

3.4. 納米結構脂質載體（Nanostructured Lipid Carriers，NLCs）
納米結構脂質載體（NLCs）可被視為固體脂質納米粒（SLNs）的變體或進化產物。在 NLCs 的核心中，固態脂質和液態脂質的組合營造出一種無序的環境，與 SLNs 相比，這使得藥物裝載量更高、藥物排出更少以及藥物溶解性得以提升。同樣，NLCs 也已在基因遞送方面進行了探索。具有代表性的是，Garbuzenko 等人證明，一種包載有針對 EGFR 的小干擾 RNA（siRNA）組和紫杉醇的促黃體生成素釋放激素十肽（LHRH）修飾的 NLC 納米粒子系統，增強了活性化合物、siRNA 和紫杉醇對癌細胞的遞送和療效。

3.5. 脂質納米乳液（Lipid nanoemulsions）
納米乳液（Nanoemulsions）是一種將納米級的液滴（通常為油）分散在另一種不互溶的液體（即水）中形成的分散體系，由表面活性劑或乳化劑（如脂質）進行穩定，也被稱為水包油（o/w）乳液。通常，此類納米乳液已被用于水不溶性化合物的給藥，其中油納米液滴為親脂性藥物提供了疏水環境，而介質仍為水性。陽離子納米乳液已被開發用于核酸產品的遞送，所使用的脂質也被用于開發陽離子脂質體。例如，Yi 等人報道了使用大豆油和 DOTAP（作為陽離子脂質）、DOPE 以及 PEG-PE 來制備陽離子脂質乳液以與質粒復合。作者報告稱該體系對 DNA 酶 I 具有穩定性，并且在體外成功實現了細胞轉染。在另一個實例中，Brito 等人開發了一種基于納米乳液的載體用于遞送自擴增 mRNA 疫苗，使用 DOTAP 作為氮磷比（N/P）為 7 的陽離子脂質，并發現該疫苗在體內誘導了抗體和 T 細胞反應。如上所述，納米乳液的油相允許摻入疏水性藥物。Oh 等人利用這一特性將疏水性抗癌化合物紫杉醇摻入碘化罌粟油相中。其目的是將兩種活性成分（紫杉醇和 siRNA）封裝在納米載體中以進行協同雙重治療。盡管在這種情況下，作者未使用陽離子脂質，而是使用陽離子聚合物（即聚乙烯亞胺）與針對 BCL-2 的 siRNA 復合，形成了包含兩種活性成分的納米乳液，并通過聚乙二醇化磷脂和膽固醇進行穩定。作者報告稱，組合藥物治療具有很強的細胞凋亡活性，高于單個化合物。盡管納米乳液具有諸如在同一制劑中混合多種藥物或使用具有生物相容性的天然油脂等優點，但對于其穩定性、粒徑以及使用永久性陽離子分子封裝核酸可能導致的類似陽離子脂質體的副作用等方面，仍存在一些擔憂。

3.6. 脂質納米顆粒（Lipid nanoparticles，LNPs）
脂質納米顆粒（LNPs）在 RNA 遞送方面的應用近期得到了積極且廣泛的探索。LNPs 在實現開創性的治療方面發揮了重要作用，例如 Patisiran（基于 siRNA 的治療藥物）獲批，以及在 COVID-19 大流行期間基于 mRNA 的疫苗中的應用。與病毒載體相比，LNPs 通常具有更低的免疫原性風險，同時能夠攜帶相對較大的核酸有效載荷，并且正如近期的 COVID-19 疫苗所顯示的，其生產能夠實現規模化。毫不意外，基于 LNP 的核酸給藥治療的研究與開發得以加速，并且有多項臨床應用正在接受評估。實際上，LNPs 已在針對由寨卡病毒、基孔肯雅病毒和流感等引起的不同傳染病的臨床試驗中接受測試。以下部分還將列出臨床試驗，以表明 LNPs 一直是這一方法的基石。

LNPs 的多功能性、有效遞送各類核酸的能力以及良好的生物相容性，使其成為在遺傳疾病、癌癥、傳染病等領域推動治療干預手段發展的極具前景的平臺。最后，關于開發可電離脂質的研究正在大量開展，這些脂質是基于 LNP 制劑的主要成分及其潛力所在。這些分子有助于核酸復合與內體逃逸，相比永久性帶電荷的陽離子脂質，合成具有更優轉染特性且毒性更低的新型分子已成為一個研究熱點領域。

3.6.1. LNPs 的基本原理
LNPs 的治療潛力取決于諸多關鍵因素，涵蓋化學組成、轉染能力、理化特性、生物可降解性以及免疫原性等，這些因素在每種制劑的初始優化階段均可被設計或調整。脂質成分主要是 LNPs 的決定性材料。然而，制劑配方和制造工藝會對最終產品產生顯著影響。

最初，LNP 的特性是由不同脂質成分的組合產生的，而非僅僅取決于單一脂質，脂質的協同作用是必需的。常用于納米顆粒的脂質通常為兩親性分子，兼具親水和疏水部分，不同類型的脂質有助于納米顆粒核心的形成，并促成諸如多層囊泡或納米尺寸下均一的核殼結構的形成，以封裝核酸。然而，需要早期注意的是，用于遞送短核酸（如 siRNAs 或 miRNAs）的 LNP 制劑，在與較大分子量的核酸（如 mRNAs）相比時，可能不一定展現出相同的優勢、物理特性或轉染能力。隨后，結構上的差異，例如 mRNA 比 siRNA 更長、電荷密度、所使用的脂質或核酸產物的穩定性等，可能需要針對每種 LNP 制劑進行優化，因為通常認為為短 RNA（即 siRNAs）開發的 LNP 制劑對于 mRNAs 或 DNAs 可能并非有效。

典型的LNP配方（prototypical LNP formulation）由以下四個主要結構成分組成：陽離子（cationic）或可離子化的脂質（ionizable lipid）、膽固醇（cholesterol）、輔助脂質（helper lipid）和PEG化的脂質（PEGylated lipid）。最終脂質混合物中脂質的摩爾比可根據治療靶點而變化。

不同材料的原理及其選擇會對最終產品的穩定性、封裝效果和轉染能力等產生影響。簡而言之，帶正電荷的可電離或陽離子脂質有助于包裹核酸，并有助于破壞內吞體膜，從而將核酸釋放到細胞質中。可電離脂質促進 pH 依賴的質子化，在生理 pH 下呈現中性電荷，能夠將與陽離子脂質相關的潛在細胞毒性效應降至最低。因此，可電離脂質的 pKa 值優選為能使其在生理 pH 下主要呈中性、在內吞體 pH 下質子化以實現內吞體逃逸的值。在這些脂質的另一端，脂質尾部影響載體的穩定性，并可能影響脂質載體與內吞體膜的融合，以便在細胞質中釋放核酸。同樣，膽固醇和輔助脂質構建了 LNPs 的脂質層，并維持了載體的結構完整性，而不同的輔助脂質會對 LNPs 的轉染能力產生影響。最后，聚乙二醇化脂質會影響體內納米顆粒的大小和循環時間。

另一方面，脂質成分之間的摩爾比、脂質與核酸之間的摩爾比以及混合流程是決定 LNPs 封裝效率、粒徑、穩定性和轉染效率的其余關鍵因素。簡而言之，需要足量的膽固醇和輔助脂質來生成能夠保護核酸含量的脂質包膜。同樣，為了封裝并充分保護核酸，需要以適當的摩爾比配備足量的可電離脂質。在以下章節中，我們將深入探究已發表的研究成果，以呈現 LNPs 中材料、條件和制劑程序的這種復雜相互作用，提供最常用的摩爾比、脂質和制劑方法，同時舉例說明這些特性/材料如何影響最終產品。

3.6.2. LNPs 中陽離子/可離子化脂質的選擇
選擇合適的陽離子/可離子化脂質對于 LNP 制劑至關重要。需要注意的是，在 LNP 制劑的脂質組合中，陽離子/可離子化脂質占比較大。陽離子脂質包含帶正電荷的胺基、親脂性尾部以及連接親水部分（胺基）與疏水尾部的連接基。它們可分為單價脂肪族脂質、多價脂肪族脂質和陽離子膽固醇衍生物。基于脂質體配方的陽離子脂質用于基因傳遞的應用在 20 世紀 80 年代開始凸顯，有助于提高轉染效率，盡管最初面臨的挑戰主要與有效載荷的封裝有關。1987 年，Felgner 等人用 1,2-二油酰-3-三甲基銨丙烷（DOTAP）和 1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基銨丙烷（DOTMA）制備了單層脂質體，能在體外有效地封裝和轉染質粒 DNA。陽離子脂質在 RNA 傳遞中也有效。其他常用的陽離子脂質包括二辛基酰胺基甘氨酰精胺（DOGS）、2,3-二油酰氧基-N-[2-(精胺羧酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙銨（DOSPA）、二甲基二十八烷基溴化銨（DDAB）和 3β[N-(N′, N′-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]膽固醇（DC-Chol）等。盡管 RNA 的包裹依賴于帶正電荷的陽離子脂質與帶負電荷的 RNA 之間的靜電相互作用，但永久性帶正電荷的脂質通常與細胞毒性相關，主要是由于一級、二級、三級或四級銨基頭部基團，并且由于單核吞噬系統的吞噬作用而迅速被清除。DOTAP，一種基于陽離子脂質的 siRNA-LNP，被發現會增加肝酶釋放，提示可能存在肝毒性和 Toll 樣受體介導的炎癥反應。

這些不足之處促使新型脂質的研發。為應對諸如 DOTAP 分子這類基于季銨鹽的陽離子脂質所產生的毒性，陽離子脂質的頭部基團通過胍基、脒基、吡啶基和咪唑基進行修飾，以分散正電荷。此類脂質包括二 C14 -脒、AtuFECT01、Atu027、DODAG - 9、DiLA2、C12ANHC18 以及跨學科合成兩親分子（SAINT）。胍基官能化的脂質具有在較寬 pH 范圍內質子化的優勢，是 RNA 遞送的良好選擇。

開發了一種新型的脂質，即離子化脂質，以進一步改善RNA的遞送效果。陽離子脂質在各種pH溶液中的正電荷相對恒定，而離子化脂質在中性pH條件下不帶電荷，但在相對酸性條件下由于質子化而帶正電荷。LNPs中的離子化脂質還能通過與內吞泡壁的負電荷相互作用，在細胞攝取和內吞泡逃逸過程中發揮作用，破壞內吞泡膜。

離子化脂質包含三個結構片段：疏水烷基鏈、作為親水頭部基團的一個或多個親水氨基，以及一個連接基（酰胺、酯或醚）。離子化脂質介導高效核酸遞送的能力受其促進細胞攝取以及隨后將荷載釋放至靶細胞的能力的影響，這在很大程度上取決于該脂質的 pKa 值所賦予的 pH 響應特性。有人提出，離子化脂質的最優 pKa 值應介于 6.2 至 6.5 之間。在離子化脂質中，酯鍵在某些條件下可發生水解，從而影響相應脂質的凈電荷和 pKa 值。氨基頭部基團的離子化狀態通常決定了脂質的 pH 依賴性電荷，其可能會受到酯基存在與否的調節。Sabnis 等人合成了一組離子化脂質來制備 mRNA-LNPs。他們得出結論，脂質尾部結構的改變，例如去除酯基，會導致 pKa 值降低，而將頭部基團中的醇官能團替換為二甲胺并不會導致 pKa 值的改變。然而，遞送效率卻降低了。在 Ni 等人的另一篇研究論文中，報道稱對頭部基團進行特定修飾對 Kupffer 細胞和脾巨噬細胞中的 mRNA 轉染效率產生了積極影響。

DODAP 被視作研發出的第一種可離子化脂質，用于核酸的遞送。烷基鏈上雙鍵的存在情況已被用于評估可離子化脂質的基因沉默能力。簡而言之，Heyes 等人合成了一系列 DODMA 的雙尾二甲基氨基類似物，其每條烷基鏈包含一個、兩個雙鍵，這些脂質分別為：a) 不含不飽和鍵（DSDMA）；b) 每條鏈含兩個雙鍵（DLinDMA），以及；c) 每條鏈含三個雙鍵（DLenDMA）。作者報告稱，具有兩個雙鍵的可離子化脂質在基因沉默方面比具有三個雙鍵的更有效，其次是具有單個雙鍵的。更為重要的是，具有飽和烷基鏈的可離子化脂質展現出有限乃至可忽略不計的沉默能力。這與脂質形成反六角形 II 相的能力相關，其中不飽和度有利于從層狀相轉變為反六角形 II 相，促進了融合性（DLenDMA = DLinDMA > DODMA > DSDMA）。

通過引入支鏈脂質尾部，Hajj 等人證明，與具有非支鏈的 LNP 相比，具有支鏈的 LNP 中 mRNA 轉染效率提高了 10 倍。在另一項研究中，在用于促紅細胞生成素 - mRNA 遞送的 LNP 制劑中使用多尾可電離脂質 C12–200 時，發現其效力提高了 7 倍。Semple 等人基于 DLinDMA，在保持其他脂質成分不變的情況下，獨立改變脂質的連接基和頭部基團，制備了一系列脂質分子及其相應制劑以遞送 siRNA。基于 DLinDMA 修飾的可電離脂質，其連接基發生改變，生成了產物 DLinDAP、DLin-2-DMAP、DLin-C-DAP、Dlin-S-DMA 和 DLin-K-DMA，頭部基團發生改變，生成了產物 DLin-K-MPZ、DLin-K-MA、DLin-K-TMA.Cl、DLin-K2-DMA、DLin-KC2-DMA、DLin-KC3-DMA 和 DLin-KC4-DMA。他們觀察到，與含有 DLinDMA 的 LNP 相比，向可電離脂質中引入酯、氨基甲酸酯或硫醚連接鍵會導致體內活性大幅降低。相反，具有酮環連接基（即 DLin-K-DMA）的 LNP 效力約為 DLinDMA 基準的 2.5 倍。在 DLin-K-DMA 的頭部添加一個亞甲基，即 DLin-KC2-DMA 脂質，效力顯著提高；然而，進一步添加更多亞甲基，即 DLin-KC3-DMA 和 DLin-KC4-DMA 脂質，導致活性大幅下降，從而得出結論，DLin-KC2-DMA 是表現最佳的可電離脂質。在一項類似的研究中，Lin 等人指出，含有 DLinDAP 的 LNP 效力低可歸因于細胞內化后內源性脂肪酶引起的水解，而在 GAPDH siRNA LNP 制劑和 RAW 264.7 細胞中使用時，不含酯鍵的 DLin-KC2-DMA、DLin-K-DMA 或 DLin-DMA 較不易受脂肪酶消化，并有助于更好地實現基因沉默。此外，研究人員報告稱，在研究中考察的其他脂質中，DLin-KC2-DMA 在基因沉默方面更有效。

DLin-MC3-DMA 已被視作 LNPs 中最有效的可電離脂質之一。Jayaraman 等人針對 56 種氨基脂質，就其 LNP 介導的針對小鼠體內凝血因子 VII 基因的體內基因沉默活性進行了全面評估，評估方式是對其氨基頭部基團及相應脂質的 pKa 值進行改變。作者確認 DLin-MC3-DMA 在嚙齒動物和非人靈長類動物中展現出了最有效的基因沉默效果，且有效劑量低。DLin-MC3-DMA 作為關鍵的可電離脂質脫穎而出，自從其作為 FDA 批準的用于治療遺傳性淀粉樣轉甲狀腺素蛋白淀粉樣變性（hATTR）的 siRNA-LNP 藥物的一部分出現以來，就展現出了強大的肝臟基因沉默作用。在 Nabhan 等人的一項有趣研究中，作者報告稱，使用由 DLin-MC3-DMA 配制的 LNP 遞送 frataxin（FXN）mRNA，在肝細胞中有效地翻譯為 mFXN 蛋白，在靜脈注射該制劑數天后，蛋白表達水平仍保持升高。

盡管 DLin-MC3-DMA 因其轉染能力已獲得廣泛認可，但人們仍在通過開發該分子的衍生物或構建新結構來努力加以改進。例如，在一項研究中，作者試圖通過對脂肪鏈尾部進行修飾并引入酯鍵來改善 DLin-MC3-DMA 的生物降解性，這將導致脂質尾部一旦被內化便分解為更親水的成分。所得產物之一 L319 顯示出生物降解性和耐受性，同時體內效力與 DLin-MC3-DMA 相當。同樣，另一種分子 3-(二甲基氨基)丙基(12Z,15Z)-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基]二十一碳-12,15-二烯酸酯（DMAP-BLP）被用于開發含 GRIN1 siRNA 的 LNPs。該制劑在體外能有效沉默神經元基因表達，顱內注射小鼠后呈現出對突觸 NMDAR 電流的選擇性降低。最后，我們需要指出兩種重要的脂質，ALC-0315（((4-羥基丁基)氮雜二基)雙(己烷-6,1-二基)雙(2-己基癸酸酯)）和 SM-102（十七碳-9-基 8-(2-羥乙基)[6-氧代-6-(十一酰氧基)己基]氨基辛酸酯），它們分別是輝瑞-生物科技（Pfizer-BioNTech）和莫德納（Moderna）公司用于 COVID-19 疫苗中 mRNA 遞送的 LNPs 制劑中的可電離脂質。

3.6.3. 膽固醇的選擇
膽固醇（Cholesterol）是細胞膜中天然存在的一種成分，對膜的流動性（membrane fluidity）、穩定性（stability）和通透性（permeability）有所貢獻。膽固醇會影響脂質層的轉變溫度和相態行為，這有助于 mRNA 從 LNPs 釋放至細胞質。因為膽固醇有助于填充磷脂之間的空間并增強脂質膜的剛性，所以能防止 LNPs 中負載物的泄漏，同時提供穩定性并促進膜融合。在基于脂質的制劑（如脂質體）中摻入膽固醇，能夠減少表面結合的蛋白質和調理作用。這種作用能改進循環半衰期，使制劑在循環中停留更久，增加其到達靶細胞的幾率。

膽固醇在 LNPs 內的定位似乎取決于多種因素，例如膽固醇與其他脂質的分子比例或者離子化脂質/其他脂質的類型。在庫爾卡尼等人開展的一項有趣研究中，作者闡述了在納米粒子中膽固醇的定位如何受到該分子在離子化脂質油相中的溶解性以及與輔助脂質（在本文中為 DSPC）相互作用的影響。進一步而言，在這種情況下，DSPC 與膽固醇的摩爾比需要被考慮或優化，以實現完整外表面單分子層的恰當形成。過量的膽固醇可能導致該分子形成晶體結構以及隨后的粒子不穩定性，另一組在大約同一時間也有類似的觀察發現。總體而言，在多種含不同離子化脂質的 LNP 配方中，膽固醇含量在總分子脂質含量中的占比主要為約 37%至 40%。Moderna 和輝瑞 - 生物科技均在其基于 LNP 的 COVID-19 疫苗配方中使用了膽固醇。

膽固醇分子的修飾可能會影響其與 LNPs 其他成分的相互作用，潛在地影響納米粒子保持穩定和/或靶向特定細胞或組織的能力。Patel 等人探究了不同膽固醇類似物在 LNPs 中的作用，并指出膽固醇羥基的極性、甾醇環發生構象變化的靈活性以及膽固醇中烷基尾的長度是維持高轉染效率的重要因素。在 Paunovska 等人開展的另一項研究中，作者在 LNP 配方中采用了六種不同的膽固醇變體，并得出結論：由酯化膽固醇衍生物（如膽固醇油酸酯）配制而成的 LNPs 與常規及氧化膽固醇相比，在核酸遞送方面表現更優。此外，在體內轉染期間，膽固醇烴尾的氧化修飾比 B 膽固醇環的修飾更易被容忍，這可能會帶來遞送效果的提升。Eygeris 等人研究了不同天然存在的膽固醇類似物（如β-谷甾醇、巖藻甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和維生素 D2）對 mRNA-LNP 遞送的影響。他們表明，用植物甾醇替代膽固醇會導致形態、結晶度、層狀結構、脂質分配、熱響應和基因轉染等方面出現不同程度的變化。與其他相比，由β-谷甾醇配制的 LNPs 在體外表現出較高的層狀結構、較少的內部缺陷和較高的 mRNA 轉染能力。據報道，由維生素 D2 配制的 LNPs 由于脂質膜的流動性而具有較高的脆性，這使其無法有效地穿過細胞膜。

3.6.4. 磷脂的選擇
磷脂（Phospholipids）在 LNP 的形成和功能中是不可或缺的輔助脂質。磷脂屬于兩親性分子（amphiphilic molecules），具有親水性和疏水性部分。親水性的與磷酸相連的頭部基團可以用膽堿、乙醇胺或絲氨酸進行修飾，分別生成磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰絲氨酸（PS）等。它們能夠自發地組織成脂質層、有助于內體逃逸以及提供膜穩定性，這使得它們成為設計有效的基于 LNP 的藥物或核酸遞送系統的關鍵組成部分。常用于核酸遞送的輔助脂質包括用于磷脂酰膽堿的 DSPC、DPPC、HSPC、DOPC、POPC、SOPC ，以及用于磷脂酰乙醇胺的 DOPE、POPE、SOPE 。

由于磷脂酰膽堿（PC）具有更接近圓柱形的分子形狀，因而其天然傾向于形成有利于構建穩定脂質雙層的雙層相；而與磷脂酰乙醇胺（PE）頭部和尾部相關的圓錐形結構則促使其形成圓錐形和反向六邊形（HII）構象。脂質在 LNPs 中呈現反向六邊形（HII）相有助于促進內體膜的不穩定和融合，從而有利于核酸從內體向細胞質釋放。Arteta 等人利用可電離脂質 DLin-MC3-DMA、DSPC、膽固醇和 PEG 脂質制備了 mRNA-LNPs，并對不同尺寸的結構進行了評估。作者在 mRNA 存在的情況下鑒定出反向六邊形內部結構，并發現 DSPC 主要位于 mRNA-LNPs 的表面，粒子尺寸和表面成分會影響轉染后的蛋白質生成。脂質在水環境中所呈現的幾何結構反映了其兩親性、脂質尾部的構象位置以及它們在配方中各自的摩爾比（即“包裝參數”）。諸如 DOPE 和 DSPE 這類輔助脂質，其包裝參數大于 1，有助于形成反向六邊形（HII）相并與內體膜融合。然而，與傾向于反向六邊形（HII）相的磷脂酰乙醇胺（PE）不同，據報道，包裝參數更接近 1 的磷脂酰膽堿（PC）更傾向于層狀結構。盡管如此，我們需要指出，無論是 PE 還是 PC 這類輔助脂質，它們在配方中的摩爾比以及所使用的離子化脂質對 LNPs 中反向六邊形（HII）相的形成都有顯著影響。同時需要提醒的是，盡管 DOPE 具有諸如促融合和有利于形成反向六邊形相這樣的有益特性，但在 LNPs-siRNA 系統中，DSPC 更受青睞。不過，由于不飽和脂質尾部導致的 DOPE 流動性增加，可能會增強 LNPs 與細胞膜之間的相互作用，促進負載物的內化和細胞內釋放。

Li 等人使用 N1,N3,N5-三(2-氨乙基)苯-1,3,5-三甲酰胺（TT）脂質開發了 LNP 納米顆粒。他們的研究評估了輔助脂質對 LNP 轉染的影響，并對 DOPE、DSPC 和 POPE 進行了比較。研究人員發現，在 mRNA 遞送方面，DOPE 比 DSPC 和 POPE 更有效能。同樣，Cheng Q 等人在基于樹枝狀大分子的 LNP 配方中使用 DOPE 和 DSPC 對體內 mRNA 遞送進行了評估。作者得出結論，DOPE 在核酸遞送方面具有優勢。

有趣的是，在一項體內研究中，對具有 DOPE 或 DSPC 作為輔助脂質的相同 LNP 配方進行了比較。結果表明，采用 DOPE 配制的 LNP 優先在肝臟積聚，并且在向肝臟的 mRNA 遞送方面表現優于采用 DSPC 配制的 LNP，而采用 DSPC 配制的 LNP 則優先在脾臟積聚。在一項研究中，利用可電離脂質 DLin-KC2-DMA，作者評估了在改變陽離子脂質和 PEG-c-DMA 摩爾比的同時，固定 DSPC 或 DOPE 的比例，對 LNPs 中 siRNA 封裝效率的影響。結果發現，從 DSPC 轉變為 DOPE 對 siRNA 的封裝效率有顯著影響，DOPE 在可電離脂質摩爾比高達 70％的情況下能始終保持較高的封裝效率，而在類似條件下使用 DSPC 時，封裝效率則大幅下降。在他們的研究中，Kulkarni 等人使用可電離脂質 Dlin-KC2-DMA，將 DSPC 與不飽和 PC（即 SOPC、DOPC）或 DOPE 在 LNPs 中的情況進行了比較。作者得出結論，在體外的 HeLa 細胞中，含有不飽和 SOPC 和 DOPC 的 pDNA-LNPs 展現出比含有 DSPC 或 DOPE 的 LNPs 更強的轉染能力，其中 DSPC 通常呈現出最低的轉染水平，而體內研究則表明 DOPE 在誘導轉染方面最為有效。

DSPC 被應用于首個獲得美國食品藥品監督管理局（FDA）批準的 RNAi 藥物——Patisiran（siRNA-LNP）制劑，其后還被用于 COVID-19 疫苗 mRNA-1273（Moderna，莫德納）和 BNT162b2（Pfizer-BioNTech）。由此可見，LNP 制劑中輔助脂質的選擇能夠顯著影響其物理化學性質以及與生物成分的相互作用，還會對核酸的封裝和轉染效率產生影響。

3.6.5. 聚乙二醇化脂質（PEGylated lipid）的選擇
聚乙二醇化是指將聚乙二醇（PEG）鏈連接到分子上，如藥物、蛋白質或納米顆粒，以延長其在體內的循環時間并降低免疫原性。PEG 脂質通過屏蔽納米顆粒的表面，產生“隱身”效果，從而限制血清蛋白在納米顆粒表面的吸附，并最大限度減少免疫系統對其的識別。納米顆粒表面由刷狀 PEG 分子產生的空間位阻可能導致納米顆粒在血液循環中的停留時間延長，并由于增強滲透和滯留效應（EPR）而可能在特定組織（如腫瘤）中積累。與其他脂質類似，PEG 脂質通常具有一個通常由烷基鏈構成的疏水部分，該部分會整合到脂質層中，還有一個親水部分，其中也包含從 LNPs 表面伸出的 PEG。雖然聚乙二醇化能延長納米顆粒的循環時間并降低免疫系統對其的識別，但過度的聚乙二醇化可能會妨礙 LNPs 與靶細胞的有效相互作用，導致治療效果降低，還可能由于空間位阻而阻礙 LNPs 與內體膜的融合，導致治療無效。更重要的是，PEG 脂質對 LNP 制劑和尺寸有顯著影響。在 Belliveau 等人和 Ryals 等人的兩項研究中，制劑中隨著 PEG 脂質含量的增加，粒子尺寸減小。

因此，為制劑選擇恰當的 PEG 脂質以及確定其適宜的摩爾含量以獲得恰當的 PEG 密度，對于優化 LNPs 的性能至關重要。實際上，缺少 PEG 脂質可能會導致產生較大或聚集的顆粒，而僅僅 0.5 - 2.5 mol%的 PEG 脂質就可能生成約 80 nm 大小的穩定且均質的 LNPs。Mui 等人的研究顯示，通過使用不同數量和不同類型的 PEG 脂質，1.5 mol%的 PEG-C16 和 PEG-C18 對于 siRNA-LNPs 的基因沉默效果最佳，而任何 PEG 脂質的含量超過 3.5 mol%都會削弱基因沉默效果。在其研究中，Suzuki 等人探究了與 PEG 化脂質相關的加速血液清除現象。他們描述道，PEG 脂質的選擇及其脫落特征會影響免疫反應。與脫落較慢的 PEG 脂質相比，脫落較快的 PEG 脂質所形成的 LNPs 產生的抗 PEG IgM 抗體更少。研究結果表明，在 siFVII-DSG-LNP 配方中使用的具有短酰基鏈的 PEG 脂質（DMG-PEG）比具有長酰基鏈的 DSG-PEG 表現出更強的基因沉默作用。DMG-C-PEG2000 被用于 Onpattro siRNA-LNP，而 ALC-0159 分別是 Spikevax 和 Comirnaty 這兩種 COVID-19 疫苗的 PEG 化脂質成分。

3.6.6. 合適脂質成分摩爾比的選擇
除了選擇恰當的脂質組合，找到合適的混合比例，即脂質成分之間的摩爾比，也是必要的。當前的脂質基 RNA 遞送系統，例如 LNPs，從傳統的脂質體系統中獲取了靈感，尤其是首個獲得 FDA 批準的納米藥物配方主要由較高含量的膽固醇和磷脂構成，例如 HSPC: 膽固醇: PEG 2000-DSPE 的摩爾比為 56:39:5 ，或者是不含 PEG 化脂質的 EPC: 膽固醇，其摩爾比為 55:45 。然而，LNP 配方有所不同，因為可電離/陽離子脂質是主要成分，同時還包含磷脂、膽固醇和 PEG 化脂質。在配方中，可電離和陽離子脂質相對于總脂質的比例約為 30 - 50% ，而膽固醇、磷脂和 PEG 化脂質的比例分別約為 20 - 50% 、10 - 20% 和 0.5 - 5% 。值得注意的是，脂質混合物通常在乙醇中制備。盡管在個別脂質成分的選擇上存在差異，例如選擇不同的可電離和 PEG 脂質，但幾種基于 mRNA 的 COVID-19 疫苗（特別是 BioNTech/Pfizer 的 BNT162b2 和 Moderna 的 mRNA-1273）以及首個獲批的 siRNA-LNP 療法 Onpattro 的脂質配方存在共性。mRNA-1273 疫苗和 Onpattro 中脂質成分的摩爾比均為 50:10:38.5:1.5（即：可電離脂質: 膽固醇: 輔助脂質: PEG 脂質），而 BNT162b2 的比例為 46.3:42.7:9.4:1.6 。這些療法的脂質配方在可電離脂質中存在叔胺基團方面具有相似性。在多篇研究論文中，在開發 LNPs 時，約 50:10:38.5:1.5 的相似摩爾比一直被采用。然而，在不同的情況下，合適的比例可能需要專門評估，這就需要針對不同的 mRNA 和 siRNA-LNP 配方優化這些參數，以實現高效的核酸遞送。

某些特性，例如 RNA 封裝能力，取決于 LNP 的制備方式。例如，Ball 等人制備了五種不同的制劑，其中所有脂質的含量各異，以共同遞送 siRNA 和 mRNA。他們發現，在兩種測試的極端條件之間，即（i）可電離脂質：DSPC：DOPE：膽固醇：C14-PEG 為 35：0：16：46.5：2.5 摩爾%，以及（ii）可電離脂質：DSPC：DOPE：膽固醇：C14-PEG 為 50：10：38.5：0：1.5 摩爾%，可電離脂質：DSPC：DOPE：膽固醇：C14-PEG 為 38.8：3.6：10.9：44.5：2.25 摩爾%的組成對于所有測試應用（如沉默、基因表達、尺寸和包封）而言是最優的。他們觀察到，與 LNP 相比，降低可電離脂質含量，同時增加膽固醇、輔助脂質和 PEG 脂質的含量，總體上促進了 RNA 封裝和基因傳遞，并發現兩種性能最佳的 LNP 的摩爾比為 7C1：膽固醇：C14-PEG2000：18：1（Lyso PC）為 50：23.5：6.5：20 以及 7C1：膽固醇：C14-PEG2000：DOPE 為 60：10：25：5，這表明 LNP 制劑不僅需要在脂質（此處指輔助脂質）方面進行優化，還需要針對各自的分子比例/含量進行優化。同樣，Lam 等人表明，將 PEG 脂質含量從 1.6%改變至 2.8%，可提高體內的基因表達，而進一步增加 PEG 脂質則效果遞減。Roces 等人使用不同的陽離子/可電離脂質，即 DOTAP、DDAB 和 DLin-MC3-DMA 以不同的摩爾比成功制備了 LNPs，以確定制備 LNPs 的最佳條件。在另一項研究中，Prakash 等人使用 DLin-KC2-DMA：DSPC：膽固醇：DMG-PEG 以 57.5：7.5：31.5：3.5 的摩爾比配制了 LNPs，將單鏈 siRNA 遞送至小鼠肝臟。所有這些研究都是在 LNP 制劑過程中選擇脂質及其各自摩爾比的優化過程中的代表性實例。

3.6.7. 水性緩沖液/脂質的選擇用于 RNA 以及氮磷比（N/P）
LNP 的制造過程包括使用乙醇作為陽離子/可電離脂質、磷脂、膽固醇和 PEG 脂質的溶劑來形成脂質相。此相隨后與核酸的低 pH 水溶液混合。由于我們關注的是似乎研究最為普遍的 LNP 和可電離脂質，所以我們將描述與可電離脂質相關的程序。為可電離脂質選擇合適的緩沖液和 pH 值對于其質子化至關重要。在相關文獻中，有三種緩沖液常用于核酸的溶解研究。簡要來說，代表性的例子包括 pH 為 3 - 6 的 1 - 100 mM 檸檬酸緩沖液、pH 為 4 - 6 的 20 - 50 mM 醋酸緩沖液或者 pH 為 3 的 20 mM 蘋果酸緩沖液，它們都被用于 LNP 的制備。pH 為 3 的蘋果酸緩沖液被提議用于封裝 DNA 分子，而 pH 為 4.5 的檸檬酸緩沖液被提議用于 mRNA 的封裝，因為更低的 pH 值可能導致 mRNA 降解。

優化可電離脂質與 RNA 之間的恰當比例至關重要。氮磷比（N/P）表示在 LNP 形成過程中帶正電荷的脂質與帶負電荷的核酸分子之間的比例。簡而言之，它反映了 LNP 中正負電荷的平衡。實現最佳的 N/P 比對于確保有效的復合物形成、穩定性以及核酸的遞送至關重要。例如，Hassett 等人在其配方中使用了 N/P 比為 5.67 來制備 mRNA-LNP，而 Jürgens 等人在其研究中使用 N/P 比為 3 來制備 siRNA-LNP，使用 N/P 比為 6 來制備 mRNA-LNP。在 Carrasco 等人的一項有趣研究中，作者制備了一系列 N/P 比從 2 到 16 的 LNP，同時將脂質的摩爾比固定在 50:10:38.5:1.5（KC2: DSPC: 膽固醇: DMG-PEG）。他們發現，當將 N/P 比從 8 降低到 2 時，mRNA 的封裝效率從 80%降至 40%。他們還指出，調整 N/P 比會影響 LNP 的大小，進而影響其所能容納的 mRNA 拷貝數。在另一項研究中，Ball 等人使用 N/P 比為 8.4 的 LNP 進行 siRNA 和 mRNA 的共遞送，而 Roces 等人在其研究中制備了 N/P 比為 8 的 mRNA-LNP。Philipp 等人在 mRNA-LNP 的制備中使用了 N/P 比為 3，而 Sanghani 等人在 siRNA-LNP 中使用 7.5 為最佳 N/P 比。在另一項研究中，Chen 等人得出結論，將 N/P 比從 2 增加到 12 時，效力在 N/P 比達到 6 之前逐步提高，超過 6 之后則幾乎沒有進一步的提升。最后，BNT162B2（輝瑞）和 mRNA-1273（莫德納）疫苗的 N/P 比估計為 6，而 siRNA-LNP（Onpattro）的 N/P 比據報道為 3。

另外，許多研究者關注的是 RNA 與可電離脂質的質量比（w/w）而非 N/P 比。對于單胺脂質，例如 DOTAP、DLin-MC3-DMA 或 SM-102 以及 ALC-0315，N/P 比的變化與脂質與核酸質量變化的 1:1 比例變化相對應。但對于具有多個胺基的脂質，如 DOGS 和 DOSPA，或者樹枝狀大分子，如 PAMAM，必須加以注意。輝瑞和莫德納的 mRNA COVID-19 疫苗的脂質配方中，RNA 與可電離脂質的質量比約為 0.05。然而，不同的研究表明，考慮到各個實驗室的優化過程，RNA 與可電離脂質的質量比在 0.04 至 0.2 之間變化。因此，N/P 比或 RNA 與可電離脂質的質量比（w/w）的選擇取決于多種因素，包括所使用脂質的特定性質或 RNA 的結構，以及所期望的納米粒子的特性。不出所料，從上述例子可以看出，研究者會對每個新的 LNP 配方進行優化，并且經常嘗試不同的比例以優化各自應用的性能。

3.6.8. 基于脂質制劑（lipid-based formulations）的 RNA 遞送的合成方法
3.6.8.1. 薄膜水合法（Thin film hydration）
薄膜水合法是脂質體開發中最常用的方法之一，一直被用于陽離子脂質體的開發，但在 LNPs 的生產中較少使用。該方法依賴于在揮發性有機溶劑（如乙醇或氯仿）蒸發期間形成薄脂質膜，在水合時，脂質從固相脫離并重新組裝成脂質體結構，通常為微米尺寸的多層結構。隨后，通過特定孔徑的膜擠出或超聲處理來減小顆粒尺寸，以產生納米尺寸的單層囊泡。陽離子脂質可以替代帶負電荷的脂質來開發陽離子脂質體。在傳統的脂質體配方中，藥物包封通常在水合步驟中通過藥物溶液進行，這通常會導致較低的包封率，或者基于 pH 梯度依賴的藥物裝載而進行后裝載或遠程裝載。在陽離子脂質體中，陽離子脂質位于脂質雙層上，包括表面，這使得陽離子脂質體與核酸的復合在水合期間或形成后發生。其缺點是，核酸可能留在脂質體表面，或者脂質體與核酸的復合在特定核酸-脂質比例下會導致聚集和尺寸增大，同時在放大生產或重現性方面存在挑戰。

3.6.8.2. 乙醇注射法（Ethanol injection）
乙醇注射法同樣是脂質體制備中常用的一項技術。這一原始方法已被調整用于脂質納米顆粒的制備。聚焦于可電離脂質，該方法依賴于在劇烈攪拌下將含有脂質的有機溶劑與過量的核酸低 pH 緩沖溶液混合。由于劇烈攪拌，可混溶的有機相在水相中迅速分散，從而形成脂質納米顆粒，其中電離的脂質與核酸復合并被包裹在納米顆粒內部。

例如，Khare 等人基于將脂質相逐滴混入 10 mM 檸檬酸緩沖液（pH 4）的方式制備了 siRNA - LNP。雖然這種方法能夠直接形成納米級載體，并且是一種簡便直接的方法，但其重現性、可擴展性和封裝效率令人擔憂。

3.6.8.3. T 型接頭法（T-Junction method）
作為乙醇注射法的一種替代途徑，T 型接頭混合法是一種常被采用的方法，借助泵來實現對醇溶液和緩沖溶液更可控、更精確的混合。在 T 型混合器的兩個入口通道中，各自承載著不同的液體成分，例如脂質的乙醇溶液以及含核酸的低 pH 緩沖溶液。在這兩種流體交匯的 T 型接頭處，混亂且湍急的流動有助于兩種液體迅速且充分地混合，并在出口處生成脂質納米顆粒。雖然該技術能夠實現核酸在 LNP 中的高效包封，通常包封率在 90%及以上，但與下述方法相比，所報道的顆粒尺寸也更大。此外，為實現良好的混合，需要更高的流速，這在實驗室環境中可能不太便利，會影響所制備制劑的尺寸和多分散指數。具有代表性的是，Crawford 等人利用 T 型接頭混合制備了 siRNA - LNP，其平均粒徑在 63.3 納米至 120.1 納米之間。Goswami 等人制備了粒徑約在 140 - 155 納米范圍內的 LNP，用于在甘露糖基化 LNP 中遞送自我擴增 mRNA，其包封效率高達 88%。在另一項研究中，Lazzaro 等人采用 T 型接頭混合來制備 mRNA - LNP，隨后將其遞送至 CD8 T 細胞，以評估針對編碼抗原的免疫反應。最后，Kumar 等人和 Abrams 等人分別使用 T 型接頭混合法，采用離子化脂質 DLin - MC3 - DMA 和 CLinDMA 來制備 LNP。

3.6.8.4. 微流控混合（Microfluidic mixing）
微流控裝置與技術因在 LNP 生產中的作用而備受關注。基于微流控的混合能夠實現精確控制及更優的混合效果，產生更小的粒徑、更均勻的顆粒尺寸，并減少批次間的差異，從而提高封裝效率。盡管微流控系統最初是為 LNP 的小規模生產而開發的，但經過設計可用于規模化生產，使其適用于研究及潛在的工業應用。微流控結構的設計方式使得兩種溶液在受控條件下于裝置內混合從而生成 LNP。與 T 型接頭類似，微流控裝置的一個入口連接至泵送系統，用于輸送溶解于乙醇中的脂質成分，而另一個入口則連接至低 pH 的核酸緩沖溶液，通常為 RNA。在 LNP 制備過程中，脂質溶液與核酸溶液的混合流速比（FRR）對最終 LNP 的特性及其粒徑至關重要。不同研究中使用的 FRR 值介于 1:1 至 5:1 之間（水相與脂質溶液混合），但最常用的是 3:1 的比例。

可用于混合及后續納米顆粒形成的微流控芯片類型包括 T 型、Y 型、蛇形、環形混合器和交錯魚骨微混合器（SHM）。在 T 型和 Y 型微流控系統中，脂質和緩沖液溶液在微流控裝置內的液液界面相接觸，使得在液液界面能夠受控且逐步地形成 LNP。與其他方法相比，此方法的一個顯著特點是乙醇稀釋過程緩慢，這會影響所生成 LNP 的最終尺寸。通常，兩個入口處的注射都是通過泵來實現的。相反，蛇形微流控裝置的設計是專門為增強混合而定制的。裝置內部會產生混沌對流，有助于提高所生成納米顆粒的均勻性。另外，鞘流型微流控裝置的設計能夠提供受控且明確的流動環境以及強烈的乙醇 - 緩沖液混合，可能會比 Y 型或 T 型裝置產生更優質的納米顆粒。

另一方面，SHM 微流控芯片獨特的 V 形脊狀圖案可促進高效混合、增強物質擴散，并有助于實現快速且均勻的反應，這使其非常適用于諸如生產 LNPs 等應用。將形成轉鐵蛋白偶聯脂質納米粒（Tf-LNPs）的兩種方法進行對比：單步微流控過程和傳統的多步批量混合方法。結果表明，微流控形成的 LNPs 在將 siRNA 遞送至腫瘤部位方面比多步形成的更為有效。Belliveau 等人使用 SHM 制備了 siRNA-LNPs，并觀察到在較高流速下，siRNA-LNP 的 PDI（多分散指數）和尺寸減小。

多項研究已展現出微流控混合技術（圖 3）在 LNP 開發中的優勢作用，對多種創新設計的微流控系統進行了評估，旨在改善脂質與核酸溶液的混合和/或稀釋，同時達成強效的封裝效率和轉染效果。例如，Chen 等人利用通過 PDMS 和軟光刻技術制造的微流控裝置制備了 siRNA - LNPs，在該裝置中，核酸溶液先與脂質溶液混合，隨后用緩沖溶液稀釋，實現了 90%的體內基因沉默效果（90 % gene silencing in vivo）。

圖3. 使用微流控裝置制備LNP時，需要使用泵系統來調節乙醇溶液和水溶液的流動，并在微流控芯片中混合這兩種溶液以制備LNPs。(a) 制備LNP的代表性微流控裝置；(b) 用于混合兩種溶液并制備LNPs的代表性微流控芯片。

雖然微流控系統中的魚骨設計及類似的先進混合幾何結構在可控且高效的混合方面極為有效，但在擴大規模以滿足高通量商業生產需求時仍面臨挑戰。微流控系統的一個優勢在于，相較于以往的方法，其能夠并行使用，這雖有助于簡化其放大流程，但每個微流控芯片仍需以可靠且可重復的方式維持相對較慢的流速。在微流控設計方面，人們投入了大量精力，重點在于改進這些方面。其中，環形混合器已被證實為一項有望克服上述限制的技術。在環形區域內形成的環流模式有助于徹底混合和均質化各組分。同樣，微流控平臺，即旨在利用微流控芯片的系統，也得到了開發，且通常配備有計算機控制的泵系統，用于調節溶液的流速和混合比例。例如，精密納米系統公司的 NanoAssemblr 臺式系統，能夠精確調整諸如流速、濃度和反應時間等參數。因此，此類自動化微流控系統在 LNP 制備中的應用日益廣泛。總體而言，在 LNP 制備中采用微流控技術在粒徑控制、均一性和可重復性方面為后續的體外和體內評估帶來了顯著優勢。

在表1中，我們總結了在制備LNP納米顆粒過程中需要評估的主要特性，并為每個類別提供了代表性示例。
表 1. 脂質納米顆粒（LNPs）的制備變量及材料  

在制備LNPs之后，應進行質檢和量檢以確保LNPs符合預期的包封效率、穩定性和RNA完整性。表2中列出了LNPs的代表性表征方法。

3.6.9. RNA - LNPs 的穩定性與存儲
由于 RNA 分子易于降解，LNP 的制備及長期存儲對于成功內化和實現功能而言至關重要。對 siRNA 進行諸如硫代磷酸酯取代、2′ - O - 甲基化和氟化之類的化學修飾，以及對 mRNA 的 5′ 帽和 3′ 多聚 A 尾進行修飾，能夠增強其穩定性及治療效率。將此類 RNA 有效載荷封裝于 LNPs 內可進一步防止其受到核酸酶降解。然而，這并不能確保在存儲和處理過程中的長期穩定性。盡管 Onpattro 中的 LNPs 與 Moderna 或 Pfizer 的 COVID - 19 疫苗中的 LNPs 在制備方面存在共性，但它們在保質期和存儲條件方面存在差異。Onpattro 在 2 - 8 °C 條件下可穩定 3 年，而 Pfizer 的 COVID - 19 疫苗需要在 - 80 至 - 60 °C 條件下才能在數月內保持穩定。在 Ball 等人的一項研究中，作者使用 lipidoid 306O13 制備了 siRNA - LNPs，并研究了 pH 值（3、7.4、9）和溫度（- 20、2 和 25 °C）對 LNPs 的影響。結果表明，在 2 °C 低溫下存儲時，LNPs 能保持最長時間的穩定，至少 150 天，而 pH 值對制劑的穩定性沒有影響。還有報道稱，在沒有冷凍保護劑的情況下將 mRNA - LNP 保存在 - 80 °C 會由于可能的顆粒聚集而降低基因表達，而其他外部因素，如振動和光照，也可能導致這種結果。因此，為了在不進行凍干的情況下提高存儲過程中 LNP 的穩定性，選擇合適的輔料，包括緩沖劑、滲透調節劑和冷凍保護劑，能夠最大程度減少有效載荷的降解。

相反，對懸浮液的凍干處理已被探索用于潛在地延長納米顆粒的穩定性。有趣的是，Zhao 等人表明，在體外添加 20%（w/v）的蔗糖或海藻糖可能會穩定納米顆粒的尺寸和 mRNA 的遞送效率，但凍干的納米顆粒在體內未表現出效率。他們得出結論，添加 5%（w/v）的蔗糖或海藻糖對于在液氮中脂質樣納米顆粒內 mRNA 的長期儲存可能是最優的。在另一項研究中，Kim 等人提出，在含有 10%蔗糖的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中于 -20°C 儲存 LNPs，可有效維持 LNPs 一個月的穩定性和體內效力。作為參考，Moderna 和 Pfizer 的 COVID-19 疫苗在其配方中均包含蔗糖。因此，對這些因素的恰當理解有助于確定保存 LNPs 及其負載物完整性的最佳儲存條件，確保在整個保質期內維持其治療功效。

4. RNA - LNP 候選藥物的臨床試驗（Clinical trials）
使用 LNP 制劑的臨床試驗數量正在迅速增加，其應用基于針對多種疾病（包括呼吸道合胞病毒、SARS-CoV-2、流感病毒、寨卡病毒等）以及危及生命的遺傳疾病（如癌癥）的 RNA 給藥。Alnylam Pharmaceutics 率先開發了針對轉甲狀腺素蛋白介導的淀粉樣變性的 siRNA 的 LNP 封裝制劑，成功研制出首個此類藥物 Onpattro，標志著通過 LNP 進行 RNA 遞送的新時代的到來。該 LNP 由(6Z,9Z,28Z,31Z)-肝三十六碳-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯（DLin-MC3-DMA）脂質、DSPC、膽固醇和 PEG-DMG 組成。該藥物于 2010 年首次進入臨床試驗階段，并于 2020 年獲得 FDA 批準。這標志著通過 LNP 進行核酸遞送的新時代的開啟。在 COVID-19 大流行期間，對核酸治療藥物合適的藥物遞送載體的探尋需求增加，進一步突顯了 LNP 制劑對于核酸的重要性。在全球 SARS-CoV2 大流行期間，Moderna 和 BioNTech/Pfizer 借助脂質納米顆粒作為載體，成功地將針對 COVID-19 病毒的 mRNA 進行遞送，這是 LNP 封裝的 mRNA 疫苗的又一重大突破。

2021 年 8 月，美國食品藥品監督管理局（FDA）批準了由 BioNTech/Pfizer 研發的開創性的 BNT162b2 新冠疫苗，現名為 Comirnaty。其 LNP 制劑由一種專有的可電離陽離子脂質（(4-羥基丁基)氮雜二基）雙（己烷-6,1-二基）雙（2-己基癸酸酯）、DSPC、膽固醇和 PEG 脂質組成。2022 年 1 月，Moderna 的 Spikevax 也在新冠疫情期間的一年內獲得了 FDA 的緊急使用授權（EUA）。Spikevax 包含由 LNP 封裝的 mRNA-1273，其 LNP 配方包含 SM-102（可電離脂質）、專有輔助脂質、膽固醇、DSPC 和 PEG2000-DMG。

同樣，編碼融合前 F 糖蛋白的 LNP 封裝的 mRNA-1345 被預防性地用于對抗呼吸道合胞病毒感染。目前，針對年齡≥60 歲的成年人正在進行一項 2/3 期隨機研究（NCT05127434），以評估其安全性和耐受性。此外，針對 50 歲以上成年人的 LNP-mRNA-1345 與四價流感疫苗（Afluria? Quadrivalent；NCT05330975）聯合使用的 3 期臨床試驗也在進行中。針對季節性甲型流感（H1N1/H3N2）和乙型流感（Yamagata 和 Victoria 譜系）的 mRNA-1010 LNP 疫苗在臨床試驗（NCT04956575）中進行了評估，結果顯示沒有疫苗相關的嚴重不良反應或死亡，同時引發了強烈的免疫反應。針對巨細胞病毒（CMV）的 mRNA-1647 LNP 疫苗，即 CMVictory，正在育齡婦女中進行 3 期研究（NCT05085366）。在之前的臨床研究（2 期）中，該疫苗在 CMV 血清陽性和血清陰性人群中均表現出安全性、耐受性和免疫原性反應。同樣，其他一些正在進行的針對傳染病的 mRNA-LNP 候選藥物的臨床試驗還有針對寨卡病毒的 mRNA-1893（2 期，NCT04917861）、針對尼帕病毒的 mRNA-1215（1 期，NCT05398796）、針對流感的 H1ssF-3928（1 期，NCT05755620）、針對愛潑斯坦病毒的 mRNA-1189（1 期，NCT05164094）等。

此外，LNP 封裝的 mRNA 正針對各類癌癥進行臨床試驗。例如，mRNA - 2752 編碼 OX40L T 細胞共刺激因子、IL - 23 以及 IL - 36γ 促炎細胞因子，針對復發或難治性實體瘤的 I 期臨床研究正在進行（NCT03739931）。類似地，mRNA - 4157（V9 - 40）與 Pembrolizumab 聯合（NCT03897881），目前正處于針對黑色素瘤治療的 2 期臨床研究階段。癌癥治療臨床研究中的其他 mRNA - LNP 候選藥物的實例還有 MEDI1191（1 期，NCT03946800）、SAR441000（1 期，NCT03871348）、mRNA - 2416（1/2 期，NCT03323398）、mRNA - 5671（1 期，NCT03948763）、NCI - 4650（1/2 期，NCT03480152）等。同樣，針對遺傳疾病的 mRNA - LNP 疫苗還包括針對甲基丙二酸血癥的 mRNA - 3704（NCT03810690）和 mRNA - 3705（NCT05295433）、針對丙酸血癥的 mRNA - 3927（NCT05130437）、針對鳥氨酸轉氨甲酰酶缺乏癥的 MRT5201（NCT03767270）和 ARCT - 810（NCT04442347），以及針對囊性纖維化的 MRT5005（NCT03375047）等。LNP 封裝的 mRNA - 0184 作為一種新型的研究性 mRNA 藥物候選物，正在進行 1 期臨床試驗（NCT05659264），用于治療慢性心力衰竭。

在不同的研究方法中，Intellia Therapeutics 已開發出首個針對轉甲狀腺素蛋白（hATTR）淀粉樣變性的 CRISPR/Cas9 單向導（sg）RNA 封裝的 LNP，即 NTLA - 2001（NCT04601051）。同樣，在藥物候選物的開發方面，Verve Therapeutics 的 VERVE - 102 將針對 PCSK - 9 基因的 CRISPR - Cas9 向導 RNA 封裝于 LNP 中，在 1 期試驗（NCT06164730）中進行評估。siRNA - LNP 在治療各類癌癥方面也勢頭漸起。簡而言之，NBF - 006（NCT03819387）是封裝了針對谷胱甘肽 S - 轉移酶 Pi（GSTP）的 siRNA 的 LNP，并在針對結直腸癌的 1 期臨床研究中接受評估。

在表3中，我們列出了LNPs作為mRNA、siRNA和sgRNA的載體系統對抗各種疾病的過去和正在進行的臨床試驗。顯然，LNPs是一種備受青睞的基于脂質的非病毒遞送載體系統，已在有效RNA遞送方面得到廣泛應用。

表3. 正在進行或已完成的使用LNPs的臨床試驗總結。N/A：未找到配方信息，或任何提供的信息未經同行評審且未予包含。

5. 未來展望

近年來，脂質納米顆粒（LNPs）已成為 RNA 產品遞送的極具前景的工具，在臨床前和臨床研究中備受矚目。不出所料，正在進行的深入研究不僅聚焦于 LNPs 所允許的應用，即針對不同疾病類型使用 siRNAs 或 mRNAs，還關注 LNPs 自身。例如，對可電離脂質的研究產生了最受歡迎的脂質 DLin-MC3-DMA。進一步的研究將為提高不同類型細胞（包括核酸類型，如質粒與 RNA）的轉染效率提供更多見解。例如，如上所述，頭部基團的修飾影響了庫普弗細胞和脾巨噬細胞的轉染效率，并展示了輔助脂質如何影響 LNPs 的命運。因此，細胞靶向類型、組織蓄積或免疫反應可能會受到可電離脂質和 LNP 組成的影響或調節，這表明進一步的研究可能會提供重要信息。

另一個需要考慮的因素是 LNPs 的安全性。盡管對可電離脂質和其他成分的生物相容性和生物降解性的評估工作正在進行，但仍需努力確保其副作用最小化甚至不存在，尤其是考慮到這些顆粒旨在用于遞送核酸，即生命的基本組成部分。然而，應當有一個基本的認識，即通過 LNPs 遞送的核酸主要是 mRNAs 或 siRNAs，它們不會與基因組變化相關聯。

最后，應當指出，LNPs 的長期穩定性及其凍干能力構成了另一個未來幾年可能或應當解決的研究領域。COVID-19 疫苗及其在適當運輸和儲存方面的問題表明，盡管該技術是可行的，但這些系統的實際應用仍有改進的空間。最后，從定義上講，LNPs 描述的是一種基于脂質的配方。盡管如此，已經有了一些重要的藥物遞送方法，其中一些已獲得 FDA 批準的應用，例如基于蛋白質的載體（如白蛋白），它們可能也能夠將任何潛在的副作用降至最低。雖然 mRNA 在沒有任何載體保護的情況下無法被遞送，但理想情況下，對保護或轉染載體需求有限的核酸應當是最終目標。


參考文獻：
Haque MA, Shrestha A, Mikelis CM, Mattheolabakis G. Comprehensive analysis of lipid nanoparticle formulation and preparation for RNA delivery. Int J Pharm X. 2024 Sep 10;8:100283. doi: 10.1016/j.ijpx.2024.100283.

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