在脂質(zhì)納米顆粒(LNP)中添加陽離子輔助脂質(zhì)可增加肺遞送并減少肝遞送。然而，目前尚不清楚電荷依賴性趨向性是否是普遍存在的，或者是否取決于帶電組分。本文報(bào)道了陽離子膽固醇依賴性趨向性可能不同于陽離子輔助脂質(zhì)依賴性趨向性的證據(jù)。通過測試196個(gè)LNP如何向22種細(xì)胞類型遞送mRNA，我們發(fā)現(xiàn)帶電膽固醇與帶電輔助脂質(zhì)相比導(dǎo)致了不同的肺：肝遞送比。我們還發(fā)現(xiàn)，將陽離子膽固醇與陽離子輔助脂質(zhì)結(jié)合后，在心臟以及幾種肺細(xì)胞類型(包括干細(xì)胞樣群體)中導(dǎo)致了mRNA遞送。這些數(shù)據(jù)突出了探索電荷依賴性LNP趨向性的實(shí)用性。

脂質(zhì)納米顆粒(LNPs)在靜脈注射后可將RNA治療傳遞至患者肝細(xì)胞。因此，人們對(duì)非肝組織的遞送產(chǎn)生了興趣，這通常通過三種方法實(shí)現(xiàn)。第一種方法是抑制LNPs的攝取或肝臟中治療有效載荷的后續(xù)活性。第二種方法是將活性靶向配體(包括抗體或小分子)添加到LNPs上，使其從肝細(xì)胞中重定向。Z后，第三種方法是修改LNP的化學(xué)成分，從而使內(nèi)源性運(yùn)輸遠(yuǎn)離肝細(xì)胞。這可以通過設(shè)計(jì)可電離脂質(zhì)或添加帶電荷的輔助脂質(zhì)來實(shí)現(xiàn)，這可以增加非肝：肝向性。在一個(gè)例子中，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，通過分別添加正電荷或負(fù)電荷，RNA-脂質(zhì)復(fù)合物被靶向肺或淋巴組織。在另一個(gè)例子中，用陽離子輔助脂質(zhì)1,2-二油酰基-3-三甲基銨丙烷(DOTAP)取代兩性離子磷脂1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，將LNPs從肝臟重定向到肺。隨后，其他觀察結(jié)果也被報(bào)道，包括含有第五種陽離子組分的LNPs可以被重新定向到肺。考慮到在添加陽離子輔助脂質(zhì)后增加肺：肝輸送的一致性，一個(gè)合理的假設(shè)是電荷依賴性趨向是普遍存在的，因此任何正電荷組分都應(yīng)該增加肺輸送而減少肝輸送。然而，其他觀察結(jié)果表明LNP趨向可能是復(fù)雜的，包括膽固醇結(jié)構(gòu)可以通過影響內(nèi)吞作用來影響輸送的數(shù)據(jù)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)使我們假設(shè)帶電荷的膽固醇對(duì)非肝臟輸送的影響可能與帶電荷的輔助脂質(zhì)不同。

用帶電荷的輔助脂質(zhì)配制的LNPs通常會(huì)增加肺部輸送，減少肝臟輸送，這表明電荷可能是向性的一個(gè)驅(qū)動(dòng)因素。在這里，我們報(bào)告了陽離子依賴性向性的證據(jù)，可能取決于帶電的組分。雖然我們的數(shù)據(jù)表明，在未來的LNP配方中應(yīng)該考慮陽離子膽固醇，但這項(xiàng)研究也存在一些局限性。首先，我們的研究結(jié)果是在小鼠中進(jìn)行的；解剖、生理或遺傳差異可能會(huì)使非人類靈長類動(dòng)物的輸送不同。其次，我們尚未調(diào)查LNP+0相對(duì)于LNP0+觀察到的向性變化背后的潛在生物學(xué)機(jī)制。我們計(jì)劃探索的三個(gè)機(jī)制是血清蛋白吸附、與內(nèi)吞作用受體的相互作用以及細(xì)胞的內(nèi)吞后轉(zhuǎn)化加工。第三，雖然我們使用了許多LNPs進(jìn)行觀察，但它們都是用cKK-E12配制的。因此，了解這種觀察是否與許多其他可電離脂質(zhì)一起進(jìn)行是很重要的。Z后，LNP++導(dǎo)致小鼠在早期時(shí)間點(diǎn)的一些細(xì)胞因子升高。因此，有必要對(duì)小動(dòng)物的LNP治療窗進(jìn)行表征，并確定這是否足以用于較大物種的研究。

單細(xì)胞文庫制備。
 使用BD Rhapsody單細(xì)胞分析系統(tǒng)(BD Biosciences)對(duì)整個(gè)肺和心臟細(xì)胞進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組分析。使用EasySepTM死亡細(xì)胞(Annexin V)和RBC(抗TER119)去除來消除死細(xì)胞和紅細(xì)胞。每個(gè)樣本在繼續(xù)進(jìn)行之前，用獨(dú)特的抗小鼠標(biāo)簽抗體孵育，并用RoboSep緩沖液洗滌。對(duì)于匯集樣本，一個(gè)BD Rhapsody盒裝載了40,000個(gè)細(xì)胞。然后裝載條形碼珠子，并裂解細(xì)胞。從捕獲的mRNA和樣本標(biāo)簽上，使用BD Rhapsody全轉(zhuǎn)錄組分析(WTA)擴(kuò)增試劑盒根據(jù)BD Rhapsody系統(tǒng)mRNA WTA和樣本標(biāo)簽文庫制備協(xié)議(BD Biosciences)制備cDNA文庫。使用量子比特?zé)晒庥?jì)對(duì)Z終文庫進(jìn)行定量，并使用ExperionTM自動(dòng)電泳系統(tǒng)(Bio-Rad)測量大小分布。

使用zUMIs進(jìn)行RNA映射和計(jì)數(shù)，Salmon Alevin進(jìn)行細(xì)胞散列。所有樣本都映射到GRCm39，外顯子區(qū)域被計(jì)數(shù)。輸出文件被加載到Seurat中。細(xì)胞對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化為10000的比例因子，然后使用線性變換進(jìn)行比例縮放。使用DoubletFinder識(shí)別雙重。隨后，進(jìn)行PCA和t-SNE分析，并將結(jié)果導(dǎo)出到BBrowser2中進(jìn)行分析。使用細(xì)胞搜索工具識(shí)別每個(gè)簇內(nèi)的細(xì)胞類型，并在簇上覆蓋tdTomato表達(dá)。

我們基于光場成像流式細(xì)胞儀進(jìn)行了圖像采集。該裝置由HR-FLFM、基于微流體的樣品傳輸系統(tǒng)和頻閃多色激光照明系統(tǒng)組成。我們?cè)贓clipse Ti2-U顯微鏡上構(gòu)建了HR-FLFM，該顯微鏡配備Plan Apo Lambda 100x 1.45 NA Oil物鏡(尼康)。使用定制的微透鏡陣列(RPC Photonics)在傅里葉域中劃分光場。HR-FLFM圖像由ORCA-Flash 4.0 V3數(shù)字CMOS相機(jī)(濱松光電)捕獲。樣品通過三通道微流體流量控制器和傳感器系統(tǒng)(Elveflow)通過微流體芯片傳輸。我們應(yīng)用頻閃照明方案來減少運(yùn)動(dòng)模糊，并以200 Hz的幀速率獲取圖像。相機(jī)曝光時(shí)間設(shè)置為5 ms，而頻閃照明的有效曝光時(shí)間為100 μs。

對(duì)采集的圖像進(jìn)行閾值濾波，以去除視野中沒有成像目標(biāo)的空白幀。對(duì)于多色成像，根據(jù)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的熒光信號(hào)選擇相鄰幀并將其分組。然后對(duì)分組后的圖像進(jìn)行滾動(dòng)球背景減除和ACsN去噪算法，以提高圖像信噪比。然后，在進(jìn)行三維重建之前，應(yīng)用圓形掩模來突出每個(gè)元素圖像。在重建過程中，我們使用Titan RTX顯卡(Nvidia)來加速Richardson-Lucy反卷積過程。我們使用大約50次迭代來實(shí)現(xiàn)每個(gè)三維體積的高分辨率亞細(xì)胞成像。

我們通過量化196個(gè)LNP在體內(nèi)將mRNA遞送至5個(gè)組織的22種細(xì)胞類型的方式來測試這一假設(shè)。我們進(jìn)行了4個(gè)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)測試一個(gè)帶有給定電荷的文庫。一個(gè)文庫作為肺遞送的陰性對(duì)照，包含含有中性膽固醇和中性輔助脂質(zhì)的LNP，因此命名為(00)。其他三個(gè)文庫包含中性膽固醇和陽離子輔助脂質(zhì)(0+)，據(jù)報(bào)道可增加肺遞送并減少肝遞送；陽離子膽固醇和中性輔助脂質(zhì)(+0)；或陽離子膽固醇和陽離子輔助脂質(zhì)(++)。為了確保遞送中的任何差異是由膽固醇或輔助脂質(zhì)電荷驅(qū)動(dòng)的，我們?cè)谒兴膫€(gè)文庫中使用了經(jīng)過驗(yàn)證的可離子化脂質(zhì)cKK-E12(24)和聚乙二醇-脂質(zhì)(PEG-脂質(zhì))C14PEG2000。為了控制摩爾比依賴效應(yīng)，我們使用8種比例配制每個(gè)LNP。這導(dǎo)致了216個(gè)化學(xué)上不同的LNPs(圖1A和B)。 在使用微流體設(shè)備配制LNPs后，我們使用動(dòng)態(tài)光散射(DLS)檢查了化學(xué)成分和水動(dòng)力直徑之間的關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)，使用中性膽固醇和陽離子輔助脂質(zhì)配制的LNPs形成的顆粒在統(tǒng)計(jì)上比其他組大； 需要注意的是，每組的顆粒數(shù)量非常大(圖1C)。 我們沒有觀察到水動(dòng)力直徑和膽固醇或輔助脂質(zhì)摩爾比之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的關(guān)系(圖1D和E)。 在所有四個(gè)庫中，超過85%的LNPs的水動(dòng)力直徑小于200 nm，并且具有單分散的DLS光譜，在4°C下儲(chǔ)存3周后，庫的水動(dòng)力直徑是一致的(SI附錄，圖S3B)。 Z后，我們使用透射電子顯微鏡(TEM)對(duì)所有四個(gè)庫進(jìn)行了成像，并再次發(fā)現(xiàn)了小的、穩(wěn)定的LNPs(SI附錄，圖S3C)。 這些生物物理數(shù)據(jù)使我們得出結(jié)論，改變不同組分的電荷不會(huì)實(shí)質(zhì)上改變LNP結(jié)構(gòu)。

圖1 四個(gè)含有不同膽固醇或輔助脂質(zhì)荷載的LNPs的文庫形成了小而穩(wěn)定的LNPs。(A和B)LNPs在四個(gè)組分的八種不同摩爾比下通過改變九種輔助脂質(zhì)和三種膽固醇配制而成，總共產(chǎn)生216個(gè)LNPs。(C)每個(gè)文庫中的LNPs(灰色)形成小(50至200 nm)LNPs，池直徑(紫色)在每個(gè)文庫的LNPs池范圍內(nèi)，表明沒有LNP聚集。0+文庫由直徑明顯較大的LNPs組成。報(bào)告的直徑包括所有八種測試的摩爾比。單因素方差分析，每個(gè)文庫的平均直徑與每個(gè)其他文庫的平均直徑相比較，***P < 0.0003。四個(gè)文庫合并報(bào)告的LNP直徑與(D)膽固醇摩爾比和(E)輔助脂質(zhì)摩爾比無關(guān)，均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

圖2 陽離子膽固醇進(jìn)入LNPs調(diào)節(jié)體內(nèi)mRNA的全身遞送。(A)每個(gè)LNP庫由攜帶Cre mRNA和DNA條形碼的LNPs組成，通過尾靜脈注射給Ai14小鼠。注射后3至4天，分離5個(gè)器官，在22種細(xì)胞類型中定量tdTomato表達(dá)。使用FACS對(duì)tdTomato+細(xì)胞類型進(jìn)行分類。從分類的tdTomato+細(xì)胞類型中提取條形碼，并使用NGS進(jìn)行測序。NGS在細(xì)胞類型水平上定量LNP體內(nèi)遞送。(B)每個(gè)庫中所有細(xì)胞類型的LNP標(biāo)準(zhǔn)化遞送。未被封裝在LNPs中的裸條形碼被發(fā)現(xiàn)少于LNPs攜帶的條形碼。標(biāo)準(zhǔn)化遞送通過兩步過程計(jì)算。首先，感興趣的細(xì)胞類型中每個(gè)條形碼的計(jì)數(shù)除以同一細(xì)胞類型中所有條形碼的總計(jì)數(shù)。第二，條形碼計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化為LNP輸入樣本(注射到小鼠的LNP池)。(C)含有陽離子膽固醇的LNPs比含有陽離子輔助脂質(zhì)的LNPs顯示出較低的肺：肝mRNA遞送。由陽離子膽固醇和陽離子輔助脂質(zhì)組成的LNPs改善了非肝：肝mRNA的傳遞。單因素方差分析，****P < 0.0001，***P = 0.0007，**P < 0.006，*P < 0.04，平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。(D)(+ 0)文庫靶向所有肝細(xì)胞類型，而非(0)。非配對(duì)t檢驗(yàn)，****P < 0.0001，***P = 0.0005，**P = 0.006，平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

圖3 正電荷位置影響體內(nèi)非肝臟：肝臟mRNA的全身遞送。(A)來自(0+)和(+0)篩選的性能Z佳的LNPs攜帶相同的四種成分摩爾比。(B)這些LNPs形成小而單分散顆粒，攜帶類似的正電荷。(C)LNP+0在所有細(xì)胞類型的肝臟遞送中勝過LNP0+。mRNA遞送也在(D)肺、(E)腎、(F)心臟和(G)脾中進(jìn)行了量化。(D-F)LNP+0和LNP0+導(dǎo)致了向肺內(nèi)皮細(xì)胞、肺免疫細(xì)胞、腎免疫細(xì)胞和心臟內(nèi)皮細(xì)胞的顯著差異mRNA遞送。未配對(duì)t檢驗(yàn)，****P < 0.0001，***P = 0.0009，**P < 0.0095，*P < 0.045，平均±SD。

圖4 LNP++將mRNA傳遞到心臟EC以及肺細(xì)胞類型。(A)LNP++由DC-膽固醇和DOTAP組成，分別作為陽離子膽固醇和陽離子輔助脂質(zhì)組分。(B和C)LNP++改善了肺：肝mRNA傳遞，并導(dǎo)致顯著的心臟EC傳遞。平均±SD。(D)LNP++靶向肺和心臟，在單細(xì)胞水平上使用HR-FLFM成像。(E)肺、心臟和肝臟的RNAscope成像。圖像上的標(biāo)尺：50 μm。(F)從注射PBS或LNP++的小鼠分離的心臟細(xì)胞的t-SNE圖示。(G)tdTomato mRNA表達(dá)重疊在心臟細(xì)胞上。通過單鏈RNA-seq在單細(xì)胞水平上證實(shí)，LNP++主要將mRNA傳遞到心臟EC。

圖5 LNP++介導(dǎo)全身性肺上皮和干細(xì)胞mRNA傳遞。(A) 以1.5 mg/kg劑量將攜帶aVHH mRNA的LNP++注射到BL/6小鼠體內(nèi)。注射后一天，在肺、心臟、腎臟、肝臟中測定aVHH表達(dá)。(B) 探索了向肺非EC細(xì)胞類型(通過血管物理上較難進(jìn)入)傳遞mRNA。(C) LNP++導(dǎo)致mRNA傳遞到上皮細(xì)胞、干細(xì)胞和免疫細(xì)胞。非配對(duì)t檢驗(yàn)，****P < 0.0001，***P = 0.0005，*P < 0.048，平均±SD。

參考文獻(xiàn)：
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