試劑盒采用酶法破碎酵母細胞壁來提取酵母質粒DNA。所采用的酵母破壁酶能有效地破壞酵母細胞壁，提高酵母質粒DNA的產量。吸附柱中采用的硅基質材料能高效、專一地吸附DNA，可最大限度去除雜質蛋白質及細胞中其他有機化合物。使用本試劑盒提取的酵母質粒DNA可適用于各種常規的分子生物學實驗，包括酶切、PCR、測序、連接和轉化等試驗。本試劑盒無需使用酚、氯仿等有毒試劑，操作安全。

儲存條件

2~8 ℃干燥保存, 有效期2年。

操作步驟

1. 取1-5 mL酵母培養物(不超過5×10⁷cells), 12000 rpm離心1 min, 盡量吸除上清(菌液較多時可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中)。
2. 酵母細胞壁的破除: 向酵母菌體中加入470 μL破壁Buffer, 充分懸浮菌體, 加入25 μL酵母破壁酶和5 μL巰基還原劑, 充分混勻, 37 ℃處理1-2 h, 期間可顛倒離心管混勻數次。12000 rpm離心1 min，棄上清, 收集沉淀。
3. 向沉淀中加入250 μL溶液YP1(請先檢查是否已加入RNase A), 充分懸浮沉淀。

注意：如果菌塊未徹底混勻，會影響裂解導致質粒提取量和純度偏低。

4. 向離心管中加入250 μL溶液YP2, 溫和地上下翻轉 6-8次使菌體充分裂解。

注意：混勻一定要溫和, 以免污染細菌基因組DNA, 此時菌液應變得清亮粘稠, 作用時間不要超過5 min, 以免質粒受到破壞。

5. 向離心管中加入350 μL溶液YP3, 立即溫和地上下翻轉6-8次, 充分混勻, 此時會出現白色絮狀沉淀。12000 rpm離心10 min, 用移液器小心地將上清轉移到另一個干凈的離心管中, 盡量不要吸出沉淀。

注意: 溶液YP3加入后應立即混合避免產生局部沉淀。如上清中還有微小白色沉淀, 可再次離心后取上清。

6. 將上一步所得上清液加入吸附柱中, 室溫放置2 min, 12000 rpm離心1 min, 倒掉收集管中的廢液, 將吸附柱重新放回收集管中。
7. 向吸附柱中加入600 μL漂洗液(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇), 12000 rpm離心1 min, 棄廢液, 將吸附柱放入收集管中。
8. 向吸附柱中加入600 μL漂洗液, 12000 rpm離心1 min, 棄廢液, 將吸附柱放入收集管中。

      9.  12000 rpm離心2 min, 將吸附柱敞口置于室溫或50 ℃溫箱放置數分鐘, 目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除, 否則漂洗液中的乙醇會影響后續的實驗如酶切、PCR等。

      10. 將吸附柱放入一個干凈的離心管中, 向吸附膜中央懸空滴加30-50 μL經65 ℃水浴預熱的洗脫液, 室溫放置2min, 12000 rpm離心1 min。

      11. 為了增加質粒的回收效率, 可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中, 室溫放置2 min, 12000 rpm離心1min。

注意事項

1. 使用前請先檢查溶液YP2和溶液YP3是否出現混濁, 如有混濁現象, 可在37 ℃水浴中加熱幾分鐘, 待溶液恢復澄清后再使用。
2. 洗脫緩沖液體積不應少于50 μL, 體積過小影響回收效率; 洗脫液的pH值對洗脫效率也有影響, 若需要用水做洗脫液應保證其pH值在8.0左右(可用NaOH將水的pH值調至此范圍), pH值低于7.0 會降低洗脫效率; DNA產物應保存在-25~ -15 ℃, 以防DNA降解。
3. 質粒得率與酵母菌株、質粒拷貝數、培養條件等因素有關。通常酵母質粒拷貝數都很低, 一般通過電泳或分光光度計法都很難檢測到, 可通過PCR或轉化大腸桿菌來檢測。
4. DNA濃度及純度檢測: 得到的基因組DNA片段的大小與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關。回收得到的DNA片段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。DNA應在OD260處有顯著吸收峰, OD260值為1相當于大約50 μg/mL雙鏈DNA、40 μg/mL單鏈DNA。OD260 /OD280比值應為1.7-1.9, 如果洗脫時不使用洗脫緩沖液, 而使用去離子水, 比值會偏低, 因為pH值和離子存在會影響光吸收值, 但并不表示純度低。

Ver. CN2023102