從終止反應(yīng)后2分鐘開始，樣本的吸光度值逐漸下降，ELISA試劑盒起始吸光度值越高其下降速度越快，為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在終止反應(yīng)后2分鐘內(nèi)讀取吸光度值。

酶標(biāo)儀應(yīng)采用雙波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，必須包括對(duì)顏色產(chǎn)物敏感和不敏感的兩個(gè)吸收峰波長(zhǎng)，在非敏感波長(zhǎng)處測(cè)定特異性顯色的吸光度值接近為零，此時(shí)測(cè)的吸光度值為容器上的劃痕、指印、背景等造成的光干擾。以TMB底物為例，其Zda吸收的波長(zhǎng)為450nm，非敏感波長(zhǎng)為630nm，雙波長(zhǎng)檢測(cè)Z終得到的吸光度值為兩者之差。雙波長(zhǎng)測(cè)定能去除背景的干擾，一般不設(shè)空白孔，否則會(huì)出現(xiàn)吸光度值為負(fù)值的現(xiàn)象。

酶標(biāo)儀的使用需強(qiáng)調(diào)儀器的維護(hù)和保養(yǎng)，酶標(biāo)儀首先應(yīng)放置通風(fēng)處，避免機(jī)器內(nèi)部尤其是濾光片發(fā)霉，在使用過程中避免酸等物質(zhì)溢出腐蝕儀器，每半年或一年請(qǐng)計(jì)量局對(duì)酶標(biāo)儀進(jìn)行檢定，并請(qǐng)廠商定期維護(hù)。比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體。酶標(biāo)儀在使用前應(yīng)先預(yù)熱15～30分鐘，測(cè)讀結(jié)果會(huì)更穩(wěn)定。五、灰區(qū)的設(shè)置

通常情況下，ELISA試劑盒定性實(shí)驗(yàn)以“陽性”和“陰性”來報(bào)告結(jié)果，兩者間有一條分界線被稱為“陽性判斷值”（cut-off value，CO值），這是定性免疫測(cè)定結(jié)果報(bào)告的依據(jù)。由于ELISA CO值的設(shè)置不能區(qū)分所有正常和異常的人群，尤其是位于CO值附近的人群，并且ELISA檢測(cè)具有以下幾個(gè)特點(diǎn)：檢測(cè)變異大（18%～65%）；不同試劑盒CO值存在差異；病毒感染存在窗口期；病毒變異后表達(dá)產(chǎn)物含量低以及個(gè)體差異等，因此在CO值附近存在一個(gè)臨床意義可疑的的區(qū)域被稱之為“灰區(qū)”，在國內(nèi)的傳染性病原體抗原和抗體檢測(cè)的ELISA試劑盒中均未涉及“灰區(qū)”的設(shè)置，但僅僅依靠CO值來決定感染的有無，尤其是對(duì)獻(xiàn)血員。因此對(duì)于檢測(cè)結(jié)果位于“灰區(qū)”的病人可采用確認(rèn)實(shí)驗(yàn)或追蹤檢測(cè)的辦法加以確診。