Clodronate Liposomes氯磷酸鹽脂質體——體內巨噬細胞清除利器

2023-04-17 00:00:00 25閱讀次數

掃碼分享

自從Nico van Rooijen教授利用巨噬細胞的內吞機制，將膜不通透性的氯磷酸（clodronate）帶入細胞內，氯磷酸被釋放，當達到一定的濃度時可引發巨噬細胞的凋亡，從而達到去除巨噬細胞的目的，成功開發出一款Clodronate Liposomes體內巨噬細胞清除劑。該試劑作為目前非常成熟，便捷的巨噬細胞清除工具，被廣泛應用。

作用原理

兩親性磷脂分子在水中可以形成同心圓形式的磷脂雙分子層球體，磷脂雙分子層中間通過水相分隔。溶解在水溶液中的氯磷酸鹽在形成脂質體的過程中被包裹進磷脂雙分子層之間的水相中（如圖1）。游離的氯磷酸鹽不能自由的通過脂質體的磷脂雙分子層。隨著脂質體被巨噬細胞吞噬，在巨噬細胞溶酶體磷酸酶的作用下，溶解在脂質體水相中的氯磷酸鹽就可以被逐步釋放出來，并累積在細胞內，當其達到一定濃度時，巨噬細胞將會受到不可逆轉的損傷，從而進入凋亡過程（如圖2）。從死亡的巨噬細胞中釋放出來的氯磷酸鹽在細胞外的半衰期極短（大約15 min），可以通過泌尿系統排除體外。

圖1.氯磷酸-脂質體（Clodronate liposomes）復合物

圖2.巨噬細胞清除原理示意圖

產品性質

1 mL脂質體體懸液中所含的氯磷酸大約為5 mg。所用的磷酸鹽緩沖液為10 mM Na2HPO4，10 mM NaH2PO4，140 mM NaCl。

體內注射方案（僅供參考）

隔日尾靜脈注射200 μL clodronate liposome，根據實驗要求制定注射日程，通過免疫組化或流式檢測巨噬細胞去除效率。

尾靜脈注射方法流程

將小鼠放在倒扣的飯盒內，從孔口拉出尾巴，小鼠的尾部有2條動脈和3條靜脈，2條動脈分別在尾部的背側面和腹側面，3條靜脈呈品字型分布，一般采用左右兩側的靜脈；

將紗布浸泡于約70℃溫水中，拿出后包裹尾巴，以達到使尾部血管擴張及軟化表皮角質的目的；

行尾部靜脈注射時，以左手拇指和食指前后摁住鼠尾，留出約2 cm一段，使皮膚緊張，靜脈更為充盈，右手持1 mL針頭注射器，使針頭與靜脈平行(小于30°角)，從尾巴的下1/4處進針，開始注入藥物時應緩慢，仔細觀察，如果無阻力，無白色皮丘出現，說明已刺入血管，可正式注入藥物。

有的實驗需連日反復尾靜脈注射給藥，注射部位應盡可能從尾端開始，按次序向尾根部移動，更換血管位置注射給藥。拔出針頭后，用棉球按住注射部位輕壓1-2 min，止血。

注：以上操作方法和劑量使用僅供參考，不同的實驗要求需自行設計實驗方案或是參考相關文獻。

不同組織巨噬細胞清除的實驗方法（僅供參考）

靶向器官/細胞	實驗方法
脾臟/紅髓區巨噬細胞	單次給藥：200 μL/小鼠（靜脈注射或腹腔注射）長期耗竭：第一次給藥劑量200 μL/小鼠，之后每隔三天給藥200 μL/小鼠
肝臟/Kupffer細胞	單次給藥：200 μL/小鼠（靜脈注射或腹腔注射）長期耗竭：第一次給藥劑量200 μL/小鼠，之后每隔三天給藥200 μL/小鼠
肺/肺泡巨噬細胞	靜脈注射（150-200 μL）聯合氣管或鼻內（50 μL）給藥獲得最佳效果
淋巴結	注射（100-200 μL）/小鼠，具體給藥方式可參考文獻
腦/小膠質細胞	腦室腦脊液注射，10 μL/小鼠，50 μL/大鼠

注：本劑量僅供參考，請根據實驗需求使用或參考文獻。

效果展示

參考案例一：

圖3：左圖是正常小鼠肝臟免疫細胞中Kupffer細胞的比例，右圖是注射Clodronate Liposomes 48小時后Kupffer細胞的比例，可以看到Kupffer細胞基本被清除[1]。

參考案例二：

圖4：上圖是小鼠LLC細胞肺癌成瘤實驗中正常腫瘤組織中的巨噬細胞（紅色熒光），下圖是氣管灌注Clodronate Liposomes腫瘤組織中的巨噬細胞（紅色熒光），可以看出腫瘤中的巨噬細胞基本被清除[2]。

FAQ

Q1:收到Clodronate liposomes后該如何操作？

A:收到氯磷酸脂質體后，如果不能馬上使用，需要放置在4℃冰箱。禁止凍存！使用時作為原液使用，不能進行稀釋。脂質體很容易發生沉淀，建議使用之前輕輕混勻，另外4℃的氯磷酸脂質體不能馬上使用，需要恢復到室溫才能進行注射。

Q2:如何將脂質體從小瓶中轉移出來？

A:從小瓶中轉移脂質體的最佳方法是使用無菌針頭注射器。這樣小瓶中剩余的脂質體懸浮液就可以保持密封和清潔。您也可以使用帶有無菌吸頭的移液器進行轉移，但最好在潔凈的環境中進行，例如在BSC罩中。

Q3: Clodronate liposomes能否用于體外巨噬細胞清除？

A:產品可以用于體外巨噬細胞的清除，但是這種方法比較適合體內實驗。主要是由于在體外培養過程中，從死亡細胞釋放的氯磷酸或者是從脂質體中“滲漏”出來氯磷酸，會一直存在于培養基中，但是在體內，氯磷酸的半衰期很短，很快就會被腎臟清除。雖然游離的氯磷酸不會進入細胞也不會進入脂質體，但是一旦他們在培養基中積累就會慢慢地進入細胞中。

Q4:在靜脈注射Clodronate liposomes后動物很快就死亡了，是什么原因？

A:一方面有可能是動物注射了不均一的脂質體懸液。建議在使用之前輕輕搖晃混勻。脂質體在體外一段時間后會發生沉降。如果在很長一段時間內需要一次注射多只動物，那么脂質體便會在注射器中發生沉淀，形成不均一懸液，這樣一來，第一只注射的計量與最后一只注射的計量就會發生明顯的變化。另外一方面有可能是脂質體剛從冰箱取出后，沒有恢復到室溫。

Q5:動物在注射Clodronate liposomes后幾天就死亡了？

A：這個可能是受到細菌的污染，體內清除巨噬細胞后會增加例如病毒粒子，細菌或者酵母感染的幾率。

Q6:靜脈注射Clodronate liposomes后大鼠脾臟/肝臟中的ED1+細胞并沒有完全消失？

A：大鼠中成熟的巨噬細胞呈現ED1和ED2雙陽性，但是有一些沒有吞噬功能的或者吞噬作用小的前體細胞也是ED1+，但是呈現ED2-。因此，所有ED2+的細胞都可以被完全清除，但是ED1+的細胞卻只能被部分清除，清除的比率取決于前體/成熟巨噬細胞的比例。

Q7: Clodronate liposomes沒有達到期望的效果？

A：氯磷酸脂質體都是大批量的生產，每批次都會對氯磷酸的濃度以及一些可能的污染物進行檢測，確保無誤后才會銷售給客戶。另外，脂質體容易收到極端溫度的影響。正確的運輸和儲存方式是4~8℃，懸液既不能被凍存，也不能被加熱超過30℃。自收到貨物起，需要在3個月內使用完，不然有可能會影響使用的效果。

Q8:在靜脈注射時，能不能增加注射的體積？

A：靜脈注射時需要依據動物的體重，不能超過0.1 mL/10 mg，但是進行腹腔注射可以適當的增加注射的體積。皮下注射需要根據注射位點的容量進行決定。

Q9:使用脂質體應注意的一些事項？

A：通過具有飽和烴鏈的脂質制備而來的脂質體實際上非常堅固，但仍需要注意以下一些事項。

①不要與有機溶劑混合，如氯仿、甲醇、乙醇、DMSO、乙醚等。

②不要添加表面活性劑，除非您必須要這樣做以裂解脂質體。

③不要加熱、接近或高于脂質主相轉變溫度，除非進行藥物加載，這需要在相變溫度以上進行孵育。

產品訂購

產品名稱	貨號	規格
Clodronate Liposomes（From Vrije Universiteit Amsterdam）體內巨噬細胞清除劑（推薦使用陰性對照40338ES05/10）	40337ES05/10	2 mL/10 mL

Control Liposomes（PBS）體內巨噬細胞清除劑空白脂質體對照	40338ES05/10	2 mL/10 mL

點擊產品名稱查看詳情

【注】40338體內巨噬細胞清除劑空白脂質體對照是相對于40337體內巨噬細胞清除劑而言的，僅在制備的過程中沒有添加氯磷酸的成分，是實驗過程中最好的陰性對照。

參考文獻

[1] Guan Z, Ding Y, Liu Y, Zhang Y, Zhao J, Li C, Li Z, Meng S. Extracellular gp96 is a crucial mediator for driving immune hyperactivation and liver damage. Sci Rep. 2020 Jul 28;10(1):12596. doi: 10.1038/s41598-020-69517-7. PMID: 32724151; PMCID: PMC7387550.

[2] Li R, Yang L, Jiang N, Wang F, Zhang P, Zhou R, Zhang J. Activated macrophages are crucial during acute PM2.5 exposure-induced angiogenesis in lung cancer. Oncol Lett. 2020 Jan;19(1):725-734. doi: 10.3892/ol.2019.11133. Epub 2019 Nov 21. PMID: 31897188; PMCID: PMC6924157.

參與評論

評論