融合化學創新的生物制造，是可持續生物經濟發展的原動力，也是當前中美科技博弈的焦點之一。生物制造的關鍵“芯片”是酶，然而現有酶的催化功能有限等問題極大地限制了生物制造的范疇。南京大學黃小強課題組，自2021年建組以來，致力于將化學與生物學相融合，以實現新酶元件的創制和新分子生化體系的開發。近期發表于Nature Catalysis。

為了開發酶的新型非天然轉化體系，課題組以烯烴還原酶（ene-reductases, ER）為切入點，建立了可見光直接激發ER的新策略，并實現了一例烯烴的不對稱自由基氫芳基化轉化（圖1）。ER是一類以黃素腺嘌呤單核苷酸（FMN）為輔因子的氧化還原酶，在自然界中可以完成C=C雙鍵的雙電子還原反應的催化。基于該酶，Hyster、Huimin Zhao、吳起以及徐鑒等，通過可見光激發電子供體-受體（EDA）絡合物的策略，開發了一系列凈還原的自由基反應體系（圖1b）。但是，黃素類似物在合成化學領域是一類廣泛應用于光氧化的催化劑。同時，自然界中存在的脂肪酸光脫羧酶的催化機制，經歷的也是可見光直接激發黃素繼而引發單電子氧化（圖1a）。受此啟發，作者提出了一種可見光直接激發ER、引發非天然自由基化學的新體系（圖1c）。

圖 1. 受自然啟發的光酶的直接激發化學。圖片來源：Nat. Catal.

作者首先設計了如圖2所示的催化循環。烯烴還原酶結合的氧化態輔因子FMN_ox被藍色LED激發，從基態到達激發態FMN_ox^*（Int. B）。激發態FMN_ox^*單電子氧化富電子芳烴，產生芳基自由基陽離子中間體以及半醌狀態黃素輔因子FMN_sq（Int. C）。隨后的自由基C-C鍵形成，生成前手性自由基中間體（Int. D）。最后，酶活性位點內的電子和質子（或氫原子）轉移，生成對映體富集的產物，并實現輔因子再生（Int. E）。

類似上述酶促自由基過程，在自然選擇過程中已被逐漸淘汰。究其原因，除了自由基反應固有的選擇性控制難題，激發態的黃素蛋白還面臨有很多的競爭途徑。首先，可見光激發的醌態黃素容易被反應環境中的還原性物質或氨基酸殘基還原（圖2，路徑b）。其次，非天然底物的單電子氧化過程必須足夠高效，以競爭過無效的電子回轉（圖2，路徑c）。第三，環境中游離的未結合黃素可能引起消旋背景反應。

圖 2. 設計的催化循環。圖片來源：Nat. Catal.

為了驗證所設計的生物催化循環方案，作者選擇了3-甲氧基噻吩和α-甲基苯乙烯作為模板底物，450-460 nm藍色LED光照，發現幾類烯還原酶可以以較低的反應性實現催化加氫芳基化。進一步研究發現，通過額外加入催化量的FMN作為添加劑，能夠顯著提高反應收率而不影響對映異構體選擇性。經過條件優化和進化改造，作者發現葡萄糖酸桿菌來源的烯還原酶（GluER）可以實現對模板反應產率為81%的高選擇性催化，產物具有（R）的選擇性（97.5:2.5 er），而來自釀酒酵母的老黃酶突變體（OYE1-F296A）的產率為65%，具有（S）的選擇性（95:5 er）。

接下來，對底物考察表明，該催化體系具有良好的底物適用范圍和官能團耐受性（圖3）。活化烯烴、內烯烴、非活化烯烴、以及各類的芳基底物，都能順利發生反應（27例，最高達99%收率）。通過使用不同的酶，該體系能夠分別獲得產物的兩個對映異構體，即實現立體發散式生物合成。同時，該反應可以以相同的效率和對映選擇性放大到1 mmol級別。

圖 3. 代表性底物。圖片改自Nat. Catal.

隨后，團隊與中科大生命學院/中科院強磁場科學中心田長麟課題組以及廈門大學王斌舉課題組合作，進行了一系列的機理研究。包括：1）紫外-可見吸收光譜鑒定可見光直接激發FMN的關鍵過程；2）低溫電子順磁共振（EPR）實驗和自由基捕獲實驗證實了該反應涉及的相關自由基中間體；3）氘代實驗探索了最后自由基終止步驟的氫來源；4）理論計算模擬解析了立體選擇性的來源。詳細內容請參考原文。

該論文第一通訊單位為配位化學國家重點實驗室、化學和生物醫藥創新研究院、南京大學化學化工學院。南京大學2022級博士研究生趙貝貝、廈門大學博士研究生馮鍵強和中國科學院強磁場科學中心于璐副研究員為論文的共同第一作者。黃小強特聘研究員，以及王斌舉教授和田長麟教授為論文的共同通訊作者。論文得到了南京大學啟動經費、科技部重點研發計劃（2022YFA0913000, 2019YFA0405600, 2019YFA0706900）、國家自然科學基金（22277053, 22121001, 21927814, 21825703）、江蘇省自然科學基金（BK20220760）等項目的支持