摘要：

我們已知 TNFα（腫瘤壞死因子 α）是一種涉及到系統性炎癥的細胞因子，同時也是屬于引起急相反應的眾多細胞因子中的一員。目前已知 TNFα 是目前市場價值較高的生物藥靶點之一，相關的原研生物藥近十年來的銷售總額持續增長，尤其是 TNFα 抑 制劑研究進入高速增長階段。TNFα 主要由巨噬細胞分泌，TNFα 生產的失調被認為與許多人類疾病有關，包括阿茲海默氏癥、癌癥、重性抑郁障礙、風濕性疾病及腸炎等。現在目前已知 TNFα 由巨噬細胞、單核細胞、中性粒細胞、 CD4 +T 細胞及 NK 細胞分泌獲得。

巨噬細胞是一種白細胞，在檢測和去除傳染性強的微生物，去除死細胞和碎片及傷口愈合發揮著重要作用。腫瘤相關巨噬細胞是腫瘤微環境的主要細胞組成部分，通常與愈后不良有關。目前的人類單核細胞系 THP-1 來源于急性單核細胞白血病患者的血液，被廣泛用于研究單核細胞和巨噬細胞的功能，癌癥和免疫學的研究，通常 THP-1 細胞以懸浮形式生長，但當使用佛波醇（PMA） 和脂多糖 （LPS）處理時，它們可被誘導分化成貼壁巨噬細胞樣細胞分泌 IL-8、TNFα 和其他標記物 ，因此可以作為人類巨噬細胞生物學的模型細胞系。

高通量靈敏檢測方法越來越被藥物靶點研究客戶所青睞，通過使用非常靈敏的可定量檢測化學方法的標記物檢測 TNFα 表達水平的方法，人們可以探索所涉及的細胞信號傳導途徑，并探索那些有效成分化合物可以減少 TNFα 分泌。

背景

這篇應用文章中，通過 THP-1 分化的巨噬細胞使用 AlphaLISA 高性能 （HP） TNFα 檢測試劑盒，我們評價幾種已知的常見的抗 炎化合物的效果，看一下如何通過具有成像功能的高性能微孔板檢測系統檢測和進行數據分析。

這里我們使用 SpectraMax i3x 多功能微孔板讀板機進行這種高通量的均相檢測，在去除培養基的經 PMA 和 LPS 激活的 THP-1 細胞中檢測到皮克水平級別 TNFα  表達水平，并進一步對使用化合物 SB202190 和白藜蘆醇進行處理。使用 SpectraMax i3x 多功能讀板機進行高通量的均相檢測，在用 PMA 和 LPS 激活 THP-1 細胞后，再用 SB202190、Static 和白藜蘆醇處理 THP-1 細胞，在培養液中檢測到皮克級別 TNFα 的表達水平。

材料

1. SpectraMax i3x 多功能微孔板讀板機（Molecular Devices P/N i3x）

2. AlphaScreen 檢測卡盒（384 HTS）（Molecular Devices P/N 0200-7018POS）

3. AlphaLISA 高性能（HP）人腫瘤壞死因子 α （TNFα） 檢測試劑盒，500 次檢測點（Perkin Elmer 商品目錄號 #AL3157C）

4. SpectraMax i3x 專用的 MiniMax 細胞成像系統

5. THP-1 細胞（ATCC 目錄 #TIB-202）

6. 脂多糖（LPS，Sigma 商品目錄號 #L2630）

7. SB202190（Sigma 目錄 #S7067）

8. 白藜蘆醇（Sigma 目錄 #554325）

9. Stattic（Sigma 目錄 #S7947）

10. 96 孔黑色透明底細胞培養微孔板（康寧 #3603）
    

11. 白色實心、低容量 384 孔微孔板（康寧 #4513）

12. Phorbol 12- 肉豆蔻酸 13- 醋酸酯（PMA，Sigma 產品目錄 #524400）

步驟

1、第 1-2 天：THP-1 細胞以 20,000 個細胞/孔，用 96 孔細胞培養微孔板處理 20 ng/mL PMA 誘導分化 48 小時。細胞在第 1 天和第 2 天在 MiniMax 成像系統上拍攝形態變化。

2、第 3 天：在 MiniMax 成像檢測前可先對細胞進行清洗，以直觀地評估其分化。細胞洗滌后在不含 PMA 的培養基中孵育 24 小時。

3、第 4-6 天：化合物 SB202190、Stattic 和白藜蘆醇起始濃度為 100 μM，培養基中按 1:3 稀釋至 0.002 μM（共 11 個濃度）。化合物后兩小時添加 LPS，以最 終濃度加入細胞中 1 μg/mL 以誘導炎癥反應 48 小時，幾個經 PMA 處理的對照細胞孔未接受。

4、在第 6 天，處理過的培養基的等分試樣和對照細胞孔從孔中移除，使用 AlphaLISA 試劑盒檢測 TNFα 表達。

TNFα AlphaLISA 檢測

參考檢測試劑盒的技術參數設置，便于進行試劑制備和標準設置，最 后通過獲得曲線回算分析樣品濃度。在這里概述方案（兩個孵育步驟），技術數據表中使用了與替代檢測方法相比，檢測靈敏度更高。由 TNFα 標準品組成的 12 點標準曲線從 0.3 pg/mL 至 100 ng/mL，每濃度四個重復孔，低體積白色 384 孔板進行檢測。另外 22 個復孔不包含標準，因此可計算 TNFα 的檢測限 （LLD）。從每個處理過的細胞孔，4 份等分試樣，每份 5 μL 轉移至 384 孔檢測的四個重復孔中。

5 μL 的 10X 抗 hTNFα 受體微珠混合物（100 μg/mL） 和生物素化抗 hTNFα 抗體 （10 nM）添加到每個檢測孔中，在室溫下孵育 60 分鐘。之后向每個孔中加入 40 μL 1.25X SA 供體微珠，并將板在室溫下孵育 30 分鐘。然后在 SpectraMax 上讀取平板配備 AlphaScreen 檢測卡盒的 i3x 讀板機（384 HTS），使用表 1 所示的設置。

表 1：AlphaScreen 的 SpectraMax i3x 讀板機的儀器設置參數

結果

 THP-1 細胞通常以懸浮形式生長，最初接種在 96 孔板中時，它們具有球形外觀。然而，在 20 ng/mL PMA 中孵育后，它們開始附著在孔底上，并采用更細長和更平整的外觀。到三天處理時，許多細胞已采用這種巨噬細胞樣形態（圖 1）。

圖 1：使用 MiniMax 細胞成像系統對 THP-1 細胞進行成像。在第 1 天，細胞表現出圓形形態。PMA 治 療 24 小時后（第 2 天），觀察到延長和扁平的細胞，在第 3 天觀察到更多此類細胞（黃色箭頭）。

培養基從含有化合物處理的 THP-1 巨噬細胞的孔中移除，并使用 AlphaLISA 檢測技術，對 SB202190、Stattic 和白藜蘆醇抑 制 TNFα 表達呈濃度依賴性。使用 SoftMax Pro 軟件中的 4 參數曲線擬合繪制結果，EC 50 值自動計算（圖 2）。曲線擬合設置包括計算統計數據的選項，包括一個獨立參數，有助于評估給定曲線擬合對數據集的適用性。

圖 2：SB202190（紅色）、static（綠色）和白藜蘆醇（藍色）對THP -1 源性巨噬細胞 TNFα 抑 制作用的觀察。

詳細信息顯示 4 參數曲線擬合，曲線擬合結果表顯示獨立性參數，該參數被轉變成條狀顯示，其中條數表示獨立程度。還顯示每種化合物的 EC 50 值。

TNFα 標準曲線（圖 3）可計算檢測樣品中的實際 TNFα 水平。所示曲線展示的是從 61.7 pg/mL 到 100 ng/mL 的檢測窗口。AlphaLISA 信號范圍完全涵蓋來自 TNF α平均范圍為 0.47 ng/mL 至 7.70 ng/mL 的處理細胞的樣品。

圖 3：TNFα 標準 4 參數擬合曲線

結論：

這些結果證明了 AlphaLISA 檢測在 SpectraMax i3x 讀板機上的高信號窗口及高靈敏度檢測。與未受刺激的細胞相比，經 LPS 刺激并經化合物處理的巨噬細胞培養基樣品中 TNFα 可定量化檢測。該檢測的所有 AlphaLISA 信號均落在 TNFα 標準曲線，因此可通過 SoftMax Pro 軟件分析獲得。

SB202190、Stattic 和白藜蘆醇的最 高測試濃度可將 TNFα 分泌降低至更低水平，高于在非 LPS 刺激的細胞中觀察到的水平。在 SoftMax Pro 中，計算曲線擬合參數的獨立性軟件用于評估并應用于這些數據集的 ，自動進行 4 參數曲線擬合的擬合優度，EC 50 值等。