如何進行氨氣檢測儀風險評估？

做過PCR的小伙伴都知道，PCR前期的驗證引物探針性能和確定最適反應條件是確保正式實驗順利進行的前提。PCR實驗中有個相當重要的工作——即是PCR擴增效率的評估。擴增效率是PCR檢測性能最重要的指標之一，也是定量分析計算結果時所需要的參數。接下來，讓小編給大家細細說來吧。

什么是擴增效率

PCR是一種DNA體外擴增技術，通常包括了30 - 50個循環周期。每個循環中，目標DNA分子的拷貝數最多會增加1倍。但在實際反應中，1個DNA分子在1個擴增循環后被成功復制的概率，也就是擴增效率E<1。而PCR的特點是反應初期目標DNA分子呈現指數增長，這個階段的擴增效率可以無限接近于1；隨后由于反應組分消耗或聚合酶活性下降或兩者共同作用，導致反應效率逐漸下降并ZZ停止。不管是定量DNA分子初始量，還是計算表達量差異，都需要精確評估PCR擴增效率。

如何評估擴增效率

標準曲線是評估PCR擴增效率最可靠和穩定的一種方法，被研究者們廣泛認可。該方法涉及到制作一系列的樣品來控制目標模板的相對數量。這些樣品通常由濃縮的原液連續稀釋而成，最常用的是10倍稀釋。使用一系列稀釋樣品，采用標準qPCR程序進行擴增獲得Cq值，ZH根據各樣品濃度及相應的Cq值繪制標準曲線，得到線性方程Cq= -klgX0+b，擴增效率E=10(-1/k)-1。利用qPCR進行定量分析時，要求擴增效率范圍在90%-110%（3.6＞k＞3.1）。

影響擴增效率的關鍵因素

PCR的效率取決于許多因素，包括以下方面：

1）檢測的性能。這取決于引物、模板的序列和結構。二級結構和分子間的相互作用都會降低PCR效率。

2）樣品基質。其中可能含有來自樣品的YZ劑和其他干擾物質，或攜帶來自上游加工步驟的試劑。檢測樣品是否有YZ作用，可使用RNA或DNA Spikes方法進行檢測，或者通過倍比稀釋得到標準曲線也可以觀察到。

3）所用試劑及其濃度。本質上，任何PCR試劑都會一定程度上限制PCR反應速率和性能。

4）競爭性反應。多重反應時，各基因的擴增存在反應成分的競爭。

5）qPCR儀器。由于儀器特定的硬件/軟件屬性和設置、以及用于提取Cq值的特定算法不同，相同的實驗中，不同的儀器會產生不同的PCR效率。

6）技術重復。一般進行3次以上的技術重復以校正實驗誤差，重復數越多精確度越高。

7）連續稀釋中的移液體積。移液體積越大，移液器誤差或操作誤差引起的影響越小。

qPCR擴增效率的判斷

qPCR擴增效率主要是通過標準曲線的線性關系方程Cq=-klgX0+b來判斷，擴增效率E在90%-110%之間時，認為擴增接近理想情況；參數R2要求≥0.98，R2越接近1，則說明Cq和X0的Log值之間的相關性越高。

那么擴增效率E表現不好，主要分為兩種情況：

1）過低的擴增效率（<90％）

可能存在的原因：

? 移液器校準不良或移液技術差。

? 不正確的稀釋導致標準曲線出現錯誤。

? 染料濃度低熒光或者儀器未校準染料。

? 引物設計不好或擴增子具有二級結構。

? 標準曲線動態范圍太小。

? Taq酶無活性或活性降低。

? 樣品YZ。

2）過高的擴增效率（> 110％）

可能存在的原因：

? 移液器校準不良或移液技術差。

? 不正確的稀釋導致標準曲線出現錯誤。

? 引物二聚體或非特異性擴增。

? 標準曲線動態范圍太小。

? 基因組DNA污染（僅限RNA模板未進行DNase I處理或DNase I消化不完全）。

Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統

Azure Cielo? 實時熒光定量PCR系統來自美國Azure Biosystems公司，可為您提供3/6檢測通道，根據實驗需求靈活配置。這款產品采用了高能LED作為光源系統，可保證光源強度高，光源一致性好；高品質的帕爾貼溫度模塊作為溫控系統，升降溫速率快，可設置12列跨度30°C的溫度梯度；ZY的CMOS拍照+光纖信號傳輸作為檢測系統，CMOS檢測靈敏度高，光纖傳輸速度快，無光損失和噪音干擾，無需ROX校準。Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統可為您的科學研究提供高JZ度、高靈敏度和高可靠性的實驗結果。

腫瘤疫苗背景

腫瘤疫苗，是一種具有預防和治 療潛力的有吸引力的替代免疫治 療選擇，是近年研究的熱點之一。針對腫瘤相關抗原（Tumor-associated antigen,TAA）或腫瘤特異性抗原 (Tumor specific antigen,TSA) 的疫苗可以特異性地攻擊和破壞抗原過表達的惡性細胞，并由于免疫記憶而實現慢性治 療反應。因此，與其他免疫療法相比，癌癥疫苗提供了特異性、安全性和可耐受的治 療。

根據腫瘤抗原的組分，癌癥疫苗大致可以分為四種類型：基于 DNA 的疫苗，基于 RNA 的疫苗，基于多肽的疫苗和基于免疫細胞的疫苗。FDA 批準的首 個個性化腫瘤疫苗 PROVENGE (Sipuleucel-T) 是一種基于免疫細胞的疫苗，用于激素難治性前列腺癌的治 療。除此之外，Moderna，BioNTech 都在布局基于 mRNA 的腫瘤疫苗。

圖 1 腫瘤疫苗抗原呈遞平臺示意圖

腫瘤疫苗有效性評估方法

生物體接種疫苗后，腫瘤抗原被帶到淋巴結，進而激活抗原特異性的 B 細胞和 T 細胞，活化的 B 細胞產生的抗體及活化的效應 T 細胞會使腫瘤內脹并誘導腫瘤細胞死亡。

圖 2 腫瘤疫苗誘導的免疫反應示意圖

如何有效的評估腫瘤疫苗的有效性是一個非常值得探討的問題，常用的腫瘤疫苗有效性驗證的方法，包括細胞因子檢測、CTL 活性檢測、T 細胞活化標志物檢測、抗體滴度檢測、ADCC 檢測等。

1、細胞因子檢測

細胞因子是由免疫細胞經過刺激而合成并分泌的小分子蛋白質，在免疫應答中起著非常重要的作用，因此可以通過細胞因子的分泌能力來反應疫苗誘導的細胞免疫的水平。常見的細胞因子有白介素 (IL) 、干擾素 (IFN)、 腫瘤壞死因子 (TNF) 等。下面比較了幾種常見的檢測方法。

ELISA 是一種非常經典的細胞因子的檢測方法，例如在王曉東等人發表的關于胃癌疫苗研究的文章中，提到了用 ELISA 的方法檢測接種疫苗后小鼠骨 髓源樹突狀細胞（BMDCs）分泌細胞因子的能力，檢測方法如下：

BMDCs 在含有 10ng/mL GM-CSF 和 10ng/mL IL-4 的 X-vivo 15 培養基中培養，37℃下培養 6 天，然后以每孔 5×104 細胞的密度在 96 孔板中接種。以 5μM 或 10μM 的最 終濃度加入疫苗抗原，孵育 24 小時。使用小鼠 TNF-α 和 IL-12 p70 ELISA Ready-SET-Go 試劑組定量培養上清中的 TNF-α 和 IL-12 。首先在 4℃下用捕獲抗體包被 ELISA 板過夜，然后在室溫下依次加入阻斷液、細胞培養上清和檢測抗體，孵育 1h 。 最 后加入終止液和顯色劑，用酶標儀 (BioTek) 在 450nm 處記錄 OD 值。

檢測結果如下：

從檢測結果可以看出，T7（TLR7 激動劑）的存在可以顯著提升 ML/MB 抗原誘導的免疫反應。

圖 3 ELISA 法測定小鼠骨 髓樹突狀細胞 (BMDCs) 分泌

TNF-α (a) 和 IL-12 (b) 的水平

Ankita Leekha 等人發表的關于 SRAS-COV2 疫苗文章中，提到了用 ELISPOT 的方法評估細胞因子的分泌水平，可以作為參考。具體方法如下：

從小鼠中分離脾細胞和肺細胞，使用小鼠 IFNγ ELISpot 基礎試劑盒和小鼠 IL4 ELISpot 基礎試劑盒 (Mabtech, VA, USA) 進行 IFNγ 和 IL4 ELISpot 檢測。在 37℃ 下，在預包被抗體的 ELISpot 板中，用抗原刺激脾細胞和肺細胞，培養 16-18 小時。第二天，洗掉細胞，加入生物素化的檢測抗體。洗板后，加入 1:30000 稀釋的 Extravidi-ALP 偶聯物，室溫孵育 1 小時。洗板后，每孔添加 70μL 顯色液，孵育 20-30min，形成斑點，然后用水清洗，干燥。使用 Cytation 7 (BioTek) 對斑點進行量化。每個點對應一個單獨的細胞因子分泌細胞。

檢測結果如下：

圖 4 ELIPSOT 方法檢測小鼠脾細胞

和肺細胞分泌細胞因子的水平

2、CTL 活性檢測

疫苗誘導的細胞毒性 T 淋巴細胞 (CTL) 可以直接殺傷腫瘤細胞，起到抗腫瘤的作用，因此可以通過檢測 CTL 的殺傷效應來反應疫苗的效果。常用的檢測細殺傷效應的方法有很多，下表列舉了一些常用的方法。

王曉東等人發表的文章中提到了 LDH 檢測，檢測方法如下：

從接種疫苗小鼠的脾 臟中分離淋巴細胞（效應細胞）。EAC 腫瘤細胞（靶細胞）與淋巴細胞（效應細胞-靶細胞比例為 50:1）共培養 4h，使用乳酸脫氫 (LDH) 法測定細胞毒性。將培養 4h 后的培養上清加入在 ELISA 板中，室溫下加入底物溶液，孵育 30min。最 后，加入終止液終止反應，并用酶標儀 (BioTek) 在 490nm 處檢測光密度。

檢測結果如下：

相對于 PBS 對照組來說，T7-MB 組 CTL 細胞具有顯著的殺傷效應。

圖 5 LDH 法測定 CTL 介導的 EAC 靶細胞的裂解水平

3、抗體滴度及親和力檢測

腫瘤疫苗除了可以誘導細胞免疫之外，也可誘導體液免疫，對此可通過對抗體滴度及親和力進行檢測來反應疫苗抗腫瘤的效果，ELISA 是一種非常經典的檢測方法。

上述關于胃癌疫苗的文章中通過 ELISA 方法測定小鼠接種疫苗后血清中總 IgG 含量，具體檢測過程如下：

小鼠接種疫苗后收集血液樣本，通過 3000g 離心 15 分鐘獲得血清樣本。ELISA 板預先在 4℃ 包被 BSA-MG1 過夜，然后在室溫下依次加載封閉溶液 2h，血清樣品 (1:50 稀釋) 和檢測抗體 1h。最 后，在體系中加入 p-NPP 底物 (Millipore) 和終止液，用酶標儀 (BioTek) 在 405nm 處記錄 OD 值。

檢測結果如下：

相對于 PBS 對照組來說，T7-MB 組抗體含量明顯上升。

圖6 ELISA法測定疫苗誘導的血清抗體水平

除此之外，在 Emily C. Gale 等人發表的關于 mRNA 遞送系統及輔劑研究的文章中，通過 ELISA 的方法測定了 mRNA OVA 模式疫苗誘導的 OVA 特異性抗體的絕 對含量及其親和力。具體檢測方法如下：

抗體濃度：小鼠接種加強疫苗后，采集血液樣品，血清按照 1:100 000 進行稀釋。采用 anti-OVA mouse IgG1 ELISA (Cayman Chemicals) 試劑，按照試劑廠家的說明進行 ELISA 實驗。使用 Synergy H1 Microplate Reader (BioTek) 在 450nm 處記錄 OD 值。根據標準曲線計算血清抗體濃度，表示 mg/mL。

抗體親和性：將 12 個梯度稀釋的血清與恒定濃度標記 HRP 的 anti-OVA 抗體 (3nM) 混合，并在 OVA 抗原包被的板中室溫孵育 2 小時，洗板后用 TMB 底物孵育，用 HCl 停止反應。測定 450nm 處的 OD 值。根據業內發現的單克隆抗體的共同親和力，假設對照抗體的 KD 為 1nM 對實驗組的 KD 值進行統計。這一假設僅影響報告的絕 對 KD 值，而不影響實驗組之間的相對差異。

檢測結果如下：

pIC 為雙鏈 RNA 結構模擬物，圖E中比較了可溶性的 pIC 和不同納米顆粒遞送系統誘導的絕 對抗體含量，從圖 E 中可以看出 2B 遞送系統誘導的 OVA 特異性抗體含量最 高。從F和G可以看出 2B 遞送系統相對于可溶性 pIC 來說誘導的 IgG 親和力也顯著升高。

圖 7 pIC/PBAE NPs 增強體液免疫

4、ADCC 檢測

疫苗誘導體液免疫產生的抗體能夠捕捉目標抗原，阻斷這個靶分子的功能，也可以引導其他免疫細胞（如巨噬細胞和自然殺傷細胞）殺死表達抗原的靶細胞，在腫瘤治 療中，特別是血液腫瘤中，抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用 (ADCC) 起著關鍵作用，ADCC 常用的檢測方法包括細胞活力檢測、LDH 檢測、工程細胞株、Delfia、RTCA、細胞成像檢測等。

王曉東等人發表的關于胃癌疫苗研究的文章中，提到了 LDH 方法檢測 ADCC，檢測方法如下：

小鼠接種疫苗后，采集其血清樣本（1:25 稀釋），然后與 EAC 細胞（靶細胞）在 37°C 孵育 30min。使用小鼠 NK 細胞分離試劑盒從正常 BALB/c 小鼠中分離出自然殺傷 (NK) 細胞（效應細胞），與抗體標記的 EAC 細胞以效靶比 50:1 共培養 4 小時。采用 LDH 法 (Promega) 測定細胞毒性，檢測方法與之前提到的 CTL 活性檢測的方法一致。

檢測結果如下：

相對于 PBS 對照組來說，T7-MB 組產生的抗體具有顯著的殺傷效應。

圖 8 LDH 法測定血清抗體介導的 EAC 靶細胞的裂解水平

腫瘤疫苗生物學活性檢測解決方案推薦

本文介紹了腫瘤疫苗活性檢測的常用方法，包括細胞因子檢測、CTL 活性檢測、抗體滴度及親和力檢測、ADCC 檢測等方法，涉及到了酶標儀、成像系統、流式、RTCA、洗板分液系統等設備。Agilent 細胞分析事業部可以從多個角度為用戶提供從樣品處理，到結果檢測再到數據分析的全面解決方案。