腫瘤疫苗背景

腫瘤疫苗，是一種具有預防和治 療潛力的有吸引力的替代免疫治 療選擇，是近年研究的熱點之一。針對腫瘤相關(guān)抗原（Tumor-associated antigen,TAA）或腫瘤特異性抗原 (Tumor specific antigen,TSA) 的疫苗可以特異性地攻擊和破壞抗原過表達的惡性細胞，并由于免疫記憶而實現(xiàn)慢性治 療反應。因此，與其他免疫療法相比，癌癥疫苗提供了特異性、安全性和可耐受的治 療。

根據(jù)腫瘤抗原的組分，癌癥疫苗大致可以分為四種類型：基于 DNA 的疫苗，基于 RNA 的疫苗，基于多肽的疫苗和基于免疫細胞的疫苗。FDA 批準的首 個個性化腫瘤疫苗 PROVENGE (Sipuleucel-T) 是一種基于免疫細胞的疫苗，用于激素難治性前列腺癌的治 療。除此之外，Moderna，BioNTech 都在布局基于 mRNA 的腫瘤疫苗。

圖 1 腫瘤疫苗抗原呈遞平臺示意圖

腫瘤疫苗有效性評估方法

生物體接種疫苗后，腫瘤抗原被帶到淋巴結(jié)，進而激活抗原特異性的 B 細胞和 T 細胞，活化的 B 細胞產(chǎn)生的抗體及活化的效應 T 細胞會使腫瘤內(nèi)脹并誘導腫瘤細胞死亡。

圖 2 腫瘤疫苗誘導的免疫反應示意圖

如何有效的評估腫瘤疫苗的有效性是一個非常值得探討的問題，常用的腫瘤疫苗有效性驗證的方法，包括細胞因子檢測、CTL 活性檢測、T 細胞活化標志物檢測、抗體滴度檢測、ADCC 檢測等。

1、細胞因子檢測

細胞因子是由免疫細胞經(jīng)過刺激而合成并分泌的小分子蛋白質(zhì)，在免疫應答中起著非常重要的作用，因此可以通過細胞因子的分泌能力來反應疫苗誘導的細胞免疫的水平。常見的細胞因子有白介素 (IL) 、干擾素 (IFN)、 腫瘤壞死因子 (TNF) 等。下面比較了幾種常見的檢測方法。

ELISA 是一種非常經(jīng)典的細胞因子的檢測方法，例如在王曉東等人發(fā)表的關(guān)于胃癌疫苗研究的文章中，提到了用 ELISA 的方法檢測接種疫苗后小鼠骨 髓源樹突狀細胞（BMDCs）分泌細胞因子的能力，檢測方法如下：

BMDCs 在含有 10ng/mL GM-CSF 和 10ng/mL IL-4 的 X-vivo 15 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃下培養(yǎng) 6 天，然后以每孔 5×104 細胞的密度在 96 孔板中接種。以 5μM 或 10μM 的最 終濃度加入疫苗抗原，孵育 24 小時。使用小鼠 TNF-α 和 IL-12 p70 ELISA Ready-SET-Go 試劑組定量培養(yǎng)上清中的 TNF-α 和 IL-12 。首先在 4℃下用捕獲抗體包被 ELISA 板過夜，然后在室溫下依次加入阻斷液、細胞培養(yǎng)上清和檢測抗體，孵育 1h 。 最 后加入終止液和顯色劑，用酶標儀 (BioTek) 在 450nm 處記錄 OD 值。

檢測結(jié)果如下：

從檢測結(jié)果可以看出，T7（TLR7 激動劑）的存在可以顯著提升 ML/MB 抗原誘導的免疫反應。

圖 3 ELISA 法測定小鼠骨 髓樹突狀細胞 (BMDCs) 分泌

TNF-α (a) 和 IL-12 (b) 的水平

Ankita Leekha 等人發(fā)表的關(guān)于 SRAS-COV2 疫苗文章中，提到了用 ELISPOT 的方法評估細胞因子的分泌水平，可以作為參考。具體方法如下：

從小鼠中分離脾細胞和肺細胞，使用小鼠 IFNγ ELISpot 基礎試劑盒和小鼠 IL4 ELISpot 基礎試劑盒 (Mabtech, VA, USA) 進行 IFNγ 和 IL4 ELISpot 檢測。在 37℃ 下，在預包被抗體的 ELISpot 板中，用抗原刺激脾細胞和肺細胞，培養(yǎng) 16-18 小時。第二天，洗掉細胞，加入生物素化的檢測抗體。洗板后，加入 1:30000 稀釋的 Extravidi-ALP 偶聯(lián)物，室溫孵育 1 小時。洗板后，每孔添加 70μL 顯色液，孵育 20-30min，形成斑點，然后用水清洗，干燥。使用 Cytation 7 (BioTek) 對斑點進行量化。每個點對應一個單獨的細胞因子分泌細胞。

檢測結(jié)果如下：

圖 4 ELIPSOT 方法檢測小鼠脾細胞

和肺細胞分泌細胞因子的水平

2、CTL 活性檢測

疫苗誘導的細胞毒性 T 淋巴細胞 (CTL) 可以直接殺傷腫瘤細胞，起到抗腫瘤的作用，因此可以通過檢測 CTL 的殺傷效應來反應疫苗的效果。常用的檢測細殺傷效應的方法有很多，下表列舉了一些常用的方法。

王曉東等人發(fā)表的文章中提到了 LDH 檢測，檢測方法如下：

從接種疫苗小鼠的脾 臟中分離淋巴細胞（效應細胞）。EAC 腫瘤細胞（靶細胞）與淋巴細胞（效應細胞-靶細胞比例為 50:1）共培養(yǎng) 4h，使用乳酸脫氫 (LDH) 法測定細胞毒性。將培養(yǎng) 4h 后的培養(yǎng)上清加入在 ELISA 板中，室溫下加入底物溶液，孵育 30min。最 后，加入終止液終止反應，并用酶標儀 (BioTek) 在 490nm 處檢測光密度。

檢測結(jié)果如下：

相對于 PBS 對照組來說，T7-MB 組 CTL 細胞具有顯著的殺傷效應。

圖 5 LDH 法測定 CTL 介導的 EAC 靶細胞的裂解水平

3、抗體滴度及親和力檢測

腫瘤疫苗除了可以誘導細胞免疫之外，也可誘導體液免疫，對此可通過對抗體滴度及親和力進行檢測來反應疫苗抗腫瘤的效果，ELISA 是一種非常經(jīng)典的檢測方法。

上述關(guān)于胃癌疫苗的文章中通過 ELISA 方法測定小鼠接種疫苗后血清中總 IgG 含量，具體檢測過程如下：

小鼠接種疫苗后收集血液樣本，通過 3000g 離心 15 分鐘獲得血清樣本。ELISA 板預先在 4℃ 包被 BSA-MG1 過夜，然后在室溫下依次加載封閉溶液 2h，血清樣品 (1:50 稀釋) 和檢測抗體 1h。最 后，在體系中加入 p-NPP 底物 (Millipore) 和終止液，用酶標儀 (BioTek) 在 405nm 處記錄 OD 值。

檢測結(jié)果如下：

相對于 PBS 對照組來說，T7-MB 組抗體含量明顯上升。

圖6 ELISA法測定疫苗誘導的血清抗體水平

除此之外，在 Emily C. Gale 等人發(fā)表的關(guān)于 mRNA 遞送系統(tǒng)及輔劑研究的文章中，通過 ELISA 的方法測定了 mRNA OVA 模式疫苗誘導的 OVA 特異性抗體的絕 對含量及其親和力。具體檢測方法如下：

抗體濃度：小鼠接種加強疫苗后，采集血液樣品，血清按照 1:100 000 進行稀釋。采用 anti-OVA mouse IgG1 ELISA (Cayman Chemicals) 試劑，按照試劑廠家的說明進行 ELISA 實驗。使用 Synergy H1 Microplate Reader (BioTek) 在 450nm 處記錄 OD 值。根據(jù)標準曲線計算血清抗體濃度，表示 mg/mL。

抗體親和性：將 12 個梯度稀釋的血清與恒定濃度標記 HRP 的 anti-OVA 抗體 (3nM) 混合，并在 OVA 抗原包被的板中室溫孵育 2 小時，洗板后用 TMB 底物孵育，用 HCl 停止反應。測定 450nm 處的 OD 值。根據(jù)業(yè)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的單克隆抗體的共同親和力，假設對照抗體的 KD 為 1nM 對實驗組的 KD 值進行統(tǒng)計。這一假設僅影響報告的絕 對 KD 值，而不影響實驗組之間的相對差異。

檢測結(jié)果如下：

pIC 為雙鏈 RNA 結(jié)構(gòu)模擬物，圖E中比較了可溶性的 pIC 和不同納米顆粒遞送系統(tǒng)誘導的絕 對抗體含量，從圖 E 中可以看出 2B 遞送系統(tǒng)誘導的 OVA 特異性抗體含量最 高。從F和G可以看出 2B 遞送系統(tǒng)相對于可溶性 pIC 來說誘導的 IgG 親和力也顯著升高。

圖 7 pIC/PBAE NPs 增強體液免疫

4、ADCC 檢測

疫苗誘導體液免疫產(chǎn)生的抗體能夠捕捉目標抗原，阻斷這個靶分子的功能，也可以引導其他免疫細胞（如巨噬細胞和自然殺傷細胞）殺死表達抗原的靶細胞，在腫瘤治 療中，特別是血液腫瘤中，抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用 (ADCC) 起著關(guān)鍵作用，ADCC 常用的檢測方法包括細胞活力檢測、LDH 檢測、工程細胞株、Delfia、RTCA、細胞成像檢測等。

王曉東等人發(fā)表的關(guān)于胃癌疫苗研究的文章中，提到了 LDH 方法檢測 ADCC，檢測方法如下：

小鼠接種疫苗后，采集其血清樣本（1:25 稀釋），然后與 EAC 細胞（靶細胞）在 37°C 孵育 30min。使用小鼠 NK 細胞分離試劑盒從正常 BALB/c 小鼠中分離出自然殺傷 (NK) 細胞（效應細胞），與抗體標記的 EAC 細胞以效靶比 50:1 共培養(yǎng) 4 小時。采用 LDH 法 (Promega) 測定細胞毒性，檢測方法與之前提到的 CTL 活性檢測的方法一致。

檢測結(jié)果如下：

相對于 PBS 對照組來說，T7-MB 組產(chǎn)生的抗體具有顯著的殺傷效應。

圖 8 LDH 法測定血清抗體介導的 EAC 靶細胞的裂解水平

腫瘤疫苗生物學活性檢測解決方案推薦

本文介紹了腫瘤疫苗活性檢測的常用方法，包括細胞因子檢測、CTL 活性檢測、抗體滴度及親和力檢測、ADCC 檢測等方法，涉及到了酶標儀、成像系統(tǒng)、流式、RTCA、洗板分液系統(tǒng)等設備。Agilent 細胞分析事業(yè)部可以從多個角度為用戶提供從樣品處理，到結(jié)果檢測再到數(shù)據(jù)分析的全面解決方案。

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