技術速遞丨使用Biozen dSEC -7色譜柱進行質粒線性化過程控制

來源：天津博納艾杰爾科技有限公司      分類：應用方案 2024-11-26 13:23:11 25閱讀次數

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概述

線性質粒在 mRNA 藥物生產的體外轉錄（IVT）中發揮重要作用（它們在此過程中作為 DNA 模板）。為此，需要產生具有所需序列的環狀質粒，并利用限制性內切酶將其轉化為線性質粒。這個過程需要以過程分析的形式進行質量控制。本文提出的尺寸排除色譜（SEC）分析被證明是一種適用于線性和環狀質粒的尺寸分離方法。

樣品制備

步驟	描述
樣品預處理	通過加入 20 μL 的 10 份 rCutSmart? 緩沖液（NEB?）、4 μL 的 AlwNI（NEB）和 116 μL 的水，在 37 ℃ 下孵育過夜，完成對 pUC-19 的線性化
加載	質粒純化柱（PCR 和 DNA 清理試劑盒，NEB），帶線性化的 pUC-19 樣品
清洗	使用清洗緩沖液清洗 2 次
洗脫	無 RNA 酶水
重構	用無 RNA 酶水稀釋至 0.1 mg/mL

LC 條件

色譜柱：Biozen 3 μm dSEC-7

規格：150 x 4.6 mm

貨號：00F-4789-E0

流動相：2 x Phosphate Buffered Saline

流速：0.1 mL/min (Isocratic)

進樣量：3 μL

溫度：25 ℃

LC 系統：Vanquish? Duo UHPLC

檢測器：UV @ 260 nm

圖 1 顯示，線性化過程后沒有剩余的環狀或超螺旋 DNA。圖 2 顯示，線性 DNA 和環狀質粒以 1:3 的比例混合，以模擬不完全酶切的過程控制樣品。數據表明，環狀質粒和線性質粒之間的分離是可能的，并且可以使用 Biozen dSEC-7 柱進行線性化監測。

峰序號	分析物	保留時間（min）
1	環狀 pUC19	9.375
2	超螺旋 pUC19	19.015

峰序號	分析物	保留時間（min）
1	線性  pUC19	8.970

圖 1. 環狀 pUC19（上）和線性化后的色譜圖（下）

峰序號	分析物	保留時間（min）	分離度
1	線性 pUC19	8.938	1.02	-
2	環狀 pUC19	9.360		13.64
3	超螺旋 pUC19	19.015	-

圖 2. 不完全酶切狀態下模擬 pUC19 過程控制樣品的色譜圖

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