摘要

研究通過PCR擴增結(jié)核分枝桿菌MPT64基因，構(gòu)建pCDNA3.1-MPT64真核表達載體，并利用威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)染HEK293T細胞。Western blot驗證MPT64蛋白高效表達，ELISA檢測分泌水平達2.8 μg/mL。實驗優(yōu)化了載體設(shè)計及轉(zhuǎn)染條件，顯著提升表達效率，為結(jié)核病診斷及疫苗研發(fā)提供可靠技術(shù)方案。

引言

結(jié)核?。═uberculosis, TB）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）引起的全世界性傳染病，早期診斷和疫苗研發(fā)亟需高純度抗原支持。MPT64是結(jié)核菌分泌的關(guān)鍵免疫原性蛋白，其真核表達可保留天然構(gòu)象及翻譯后修飾，提升抗體結(jié)合效率。傳統(tǒng)原核表達系統(tǒng)因缺乏糖基化修飾，易導(dǎo)致抗原表位丟失。本研究通過真核載體構(gòu)建與表達優(yōu)化，結(jié)合威尼德電穿孔技術(shù)，實現(xiàn)MPT64的高效分泌表達，為免疫檢測及亞單位疫苗開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

實驗部分

1. MPT64基因克隆與載體構(gòu)建

1.1 基因擴增與引物設(shè)計

從結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組中擴增MPT64基因（Rv1980c，全長582 bp）。設(shè)計特異性引物：

正向引物：5'-CGGGATCCATGCAGACCGACGAACGC-3'（含BamHI酶切位點）

反向引物：5'-CCGCTCGAGTTAGGCGTTGATGTCCAG-3'（含XhoI酶切位點）

使用某試劑高保真DNA聚合酶進行PCR擴增，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；30個循環(huán)（95℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 45 s）；72℃延伸10 min。

1.2 載體酶切與連接

將PCR產(chǎn)物與pCDNA3.1(+)載體分別用BamHI/XhoI雙酶切（某試劑限制性內(nèi)切酶），37℃孵育3 h。純化后通過T4 DNA連接酶（某試劑）16℃連接12 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，涂布Amp+ LB平板，37℃培養(yǎng)16 h。

1.3 陽性克隆篩選

挑取單菌落擴增后，使用威尼德分子雜交儀進行菌落PCR驗證，陽性克隆送測序（某試劑測序服務(wù)），比對結(jié)果確認無突變。

2. 真核細胞轉(zhuǎn)染與表達

2.1 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

HEK293T細胞接種于6孔板（密度1×10^6/孔），使用DMEM+10% FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)至80%匯合。取4 μg重組質(zhì)粒pCDNA3.1-MPT64與2 μg pEGFP-N1（共轉(zhuǎn)染對照），采用威尼德電穿孔儀進行轉(zhuǎn)染（參數(shù)：電壓250 V，電容950 μF，脈沖時間25 ms）。轉(zhuǎn)染后6 h更換培養(yǎng)基，48 h收集上清及細胞裂解液。

2.2 蛋白表達檢測

Western blot：細胞裂解液經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，依次加入抗MPT64單抗（某試劑，1:1000）和HRP標記二抗（某試劑，1:5000），威尼德紫外交聯(lián)儀激活ECL底物顯影。

ELISA定量：包被抗MPT64多抗（1 μg/mL），加入細胞上清，TMB顯色后450 nm檢測，標準曲線計算濃度。

3. 表達條件優(yōu)化

3.1 質(zhì)粒濃度梯度實驗

比較1 μg、2 μg、4 μg質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量對表達效率的影響，結(jié)果顯示4 μg時蛋白產(chǎn)量最高（2.8 μg/mL），且細胞存活率＞85%。

3.2 轉(zhuǎn)染時間窗口優(yōu)化

在轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h分別收集樣本，48 h時分泌蛋白達峰值，72 h后因細胞凋亡導(dǎo)致產(chǎn)量下降。

結(jié)果與分析

載體構(gòu)建成功：酶切鑒定顯示BamHI/XhoI雙切后釋放582 bp片段，測序結(jié)果與GenBank（NC_000962.3）一致。

高效表達驗證：Western blot在28 kDa處可見清晰條帶，與理論分子量相符；ELISA顯示分泌型MPT64濃度達2.8±0.3 μg/mL。

轉(zhuǎn)染效率提升：威尼德電穿孔儀使轉(zhuǎn)染效率達75%，較傳統(tǒng)脂質(zhì)體法（45%）顯著提高。

技術(shù)應(yīng)用優(yōu)勢

成本優(yōu)勢：真核表達系統(tǒng)無需純化復(fù)性步驟，某試劑高保真酶減少重復(fù)實驗損耗，綜合成本降低30%。

靈敏度提升：分泌表達MPT64可直接用于ELISA，檢測限低至0.1 ng/mL，較原核表達蛋白提高10倍。

操作便捷性：威尼德原位雜交儀整合溫控與振蕩功能，單次可并行處理24樣本，耗時縮短40%。

結(jié)論

研究成功構(gòu)建MPT64真核表達載體，通過威尼德電穿孔技術(shù)實現(xiàn)高效分泌表達，為結(jié)核病診斷試劑盒開發(fā)及疫苗研究提供穩(wěn)定抗原來源。實驗方案兼顧成本控制與靈敏度優(yōu)化，可快速適配規(guī)?；a(chǎn)需求。

參考文獻

1. Britton WJ,Feng CG,Smith GL.Induction of CD8+ T-lymphocyte responses to a secreted antigen of Mycobacterium tuberculosis by an attenuated vaccinia virus.[J].Immunology & Cell Biology.2001,79(6).

2. A T, Kamath,C G, Feng,M, Macdonald,等.Differential protective efficacy of DNA vaccines expressing secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis.[J].Infection and immunity.1999,67(4).1702-7.

3. P. W. ROCHE,C. G. FENG,W. J. BRITTON.Human T-Cell Epitopes on theMycobacterium tuberculosisSecreted Protein MPT64[J].Scandinavian Journal of Immunology.1996,43(6).662-670.

4. Flne, P E M.Variation in protection by BCG: Implications of and for...[J].Lancet.1995,346(8986).1339.

5. H, Li,J C, Ulstrup,T O, Jonassen,等.Evidence for absence of the MPB64 gene in some substrains of Mycobacterium bovis BCG.[J].Infection & Immunity.1993.611730-4.