前言

質譜技術可實現完整糖肽的全面精準表征，已成為糖蛋白組學分析及生物標志物篩選的通用工具。本研究使用 ZenoTOF 7600 高分辨質譜系統，針對 124 例涵蓋乳腺癌、非癌性疾病及非疾病對照的臨床血清樣本進行分析，充分利用該系統獨特的 Zeno 阱對碎片離子的高效捕獲及精準釋放功能，極大地提升了質譜分析的靈敏度與準確性，為糖蛋白組學研究提供全新視角，充分展現了大規模糖蛋白質組分析的能力，為乳腺癌的早期診斷提供支持。

研究團隊收集了 40 例乳腺惡性腫瘤（MT）患者、43 例乳腺良性病變（BL）患者和 41 例健康對照（Con）志愿者的 124 份臨床血清樣本。樣本采集嚴格遵循倫理規范，在未進行任何治療干預前完成，并獲得受試者書面知情同意。對血清樣本中的蛋白質依次進行尿素變性、還原、烷基化、胰蛋白酶酶切及脫鹽處理，隨后采用親水作用色譜填料（Hilic) 富集糖肽。

樣品前處理完成后使用phenomenex的Kinetex XB-C18 (0.3*150mm*2.6um) 配合ZenoTOF 7600 質譜儀進行分析，研究人員針對碰撞誘導解離（CID）參數進行深度優化，以混合人血清樣本為研究對象，設置 20 - 100 范圍內的 9 個固定碰撞能量（CE）及動態 CE 進行分析(圖1a)。經大量實驗對比發現，動態 CE在鑒定糖肽數量及位點特異性糖鏈鑒定方面展現出顯著的優勢，相較于多數固定 CE 條件，動態 CE 能夠顯著提升鑒定效率，同時兼顧糖鏈與肽段鑒定效果，為復雜糖蛋白組的深度分析提供了更為優化的參數選擇（圖1b）。

本研究對 124 名女性參與者的血清樣本展開分析，其中涵蓋 40 例乳腺惡性腫瘤（MT）患者、43 例乳腺良性病變（BL）患者以及 41 例無乳腺疾病的對照（Con）樣本。針對每個樣本，均進行了蛋白質組學和糖蛋白組學分析（圖2a）。在蛋白質組層面，共鑒定出 1188 種蛋白質，其中高達97%的蛋白質 在 MT、BL和 Con 組中均被鑒定到，表明蛋白質組在不同樣本間具有較高相似性。糖蛋白組學分析結果顯示出更為豐富的多樣性，MT、BL 和 Con 組分別鑒定出 3531、5321 和 3963 種位點特異性糖鏈，分別對應 492、610 和 494 個糖基化位點，其中有 2318 種位點特異性糖鏈和 333 個糖基化位點在三組樣本中共同存在（圖2b）。從糖基化位點連接糖鏈數量分布來看，32% - 37% 的糖基化位點包含三種以上糖鏈，22% - 24% 包含兩至三種糖鏈，而40% - 44% 僅含有一種糖鏈（圖 2c）。MT 和 BL 組中不同類型位點特異性糖鏈的總體比例與 Con 組相當（圖2d）。

基于無標記定量（LFQ）技術對糖蛋白組進行定量分析，并結合主成分分析（PCA）、火山圖、層次聚類及功能富集分析等多元方法深入挖掘數據。PCA 結果顯示，利用位點特異性糖鏈進行分析時，MT、BL 和 Con 組在前三個主成分中呈現明顯分離趨勢，而蛋白質組數據未展現出顯著差異(圖3a）。三維火山圖分析表明，多數位點特異性糖鏈在 MT 和 BL共同上調（345 種）或僅在 MT 中上調（230 種），BL（162 種）或 Con（126 種）單獨上調數量相對較少(圖3b)。對位點特異性糖鏈定量結果進行聚類分析，發現 MT樣本緊密聚集形成一個獨特集群，BL 樣本呈現出明顯的分化趨勢，而 Con 樣本則自成一群，與 MT和 BL界限分明(圖3c)。相比之下，運用相同統計標準對蛋白質組結果進行分析時，僅發現少量差異表達蛋白質，且三組樣本聚類效果欠佳。這一鮮明對比充分表明，血清糖蛋白組分析蘊含著更為豐富的信息，相較于血清蛋白質組在乳腺癌診斷領域具有更顯著的優勢。對差異糖修飾進行功能富集分析，發現其對應的糖蛋白主要涉及凝血、糖胺聚糖結合、肽酶活性、免疫反應等關鍵生物學過程及膽固醇代謝等重要代謝通路，為乳腺癌發病機制研究提供重要線索(圖3d)。

為篩選乳腺癌診斷生物標志物，研究采用隨機森林模型，將樣本集隨機分為建模子集（包含 25 例 MT 樣本、28 例 BL 樣本和 26 例 Con 樣本）和驗證子集（每組各 15 例樣本）（圖4a），經蒙特卡洛交叉驗證（MCCV）篩選出 15 種位點特異性糖鏈（圖4b）。該模型在建模子集和驗證子集上均表現出高準確性，ROC曲線下面積（AUC）值分別達 0.98 和 0.99（圖4c）。對 15 種候選糖修飾標志物在 MT 和 Con樣本上進行了靶向 MS/MS 分析，有13 種糖肽能夠被檢測和定量，且有 10 種糖肽在 MT組中豐度更高，其中有6 種糖肽的豐度變化具有統計學意義。因此，這些位點特異性糖鏈可被視為潛在的乳腺癌診斷生物標志物。

本研究開發了基于 ZenoTOF 7600的完整糖肽表征方法，并展示了其在大規模臨床血清樣本糖蛋白質組定量分析中的應用。本研究篩選出的 15 種位點特異性糖鏈有望成為潛在的乳腺癌診斷生物標志物。未來，該方法有望在基礎和臨床糖蛋白質組學研究中發揮更大作用，為腫瘤精準診斷和治療提供有力支持。