【研究背景】

血管生成是指從現有血管中內皮細胞生長而生成新的血管，一旦血管開始生成，被稱為細胞的特殊內皮細胞就會開始發芽過程。由此，血管芽內皮細胞的長出標志著血管生成的開始，這一過程在生理學和病理生理學過程中至關重要。然而，細胞外基質（ECM）的機械特性如何調節細胞的形成在一定程度上被忽視了。細胞的特性是血管生成和組織工程的關鍵，它可以定向遷移到無血管區域，對終形成的血管形態起決定作用。迄今為止，各種生化信號分子因素如 MST1-FOXO1等多見報道，然而功能血管的建立需要生化和生物力學信號線索的結合，后者取決于組織工程和再生醫學中使用的生物材料的特性。

近期，北京大學口腔醫學院的郭亞茹博士以作者在Bioactive Materials發表了題為：Matrix stiffness modulates tip cell formation through the p-PXN-Rac1-YAP signaling axis的研究文章。文章報道了基質硬度通過p-PXN-Rac1-YAP信號軸調節細胞形成，這項工作不僅有助于在組織工程和再生醫學中尋找佳材料，也為腫瘤治療和病理性血管再生提供了新的治療策略。在生物材料設計和治療一些病理情況方面具有特殊意義。鄧旭亮教授為本文通訊作者。

【研究概述】

在這項研究中，作者研究了基質硬度對細胞形成的影響，并探索了基礎機制。在肝癌細胞的外層發現CD31表達更高，組織硬度也更高。基質的硬度增加可以顯著增加血管的生成和細胞富集基因的表達。硬度較大的基質增加了FAK和p-PXN的局灶黏附，提高了活性Rac1的水平，進而導致細胞骨架組織和細胞剛度增加。隨后，YAP作為下游的力效應因子被激活并易位入核，上調靶基因的表達，終促進細胞的形成。p-PXN還可以減少細胞間的連接，從而促進細胞的形成。由此表明：基質硬度可通過p-PXN-Rac1-YAP信號軸調節細胞的形成。

【研究結果】

硬度的增加還可以促進血管的生成（圖1D），從三維（3D）EC球體（圖1E）的芽入侵距離增加可證明這一點。與GM60和GM30凝膠（圖1F）相比，硬凝膠（GM90）中球體的芽數量增加了2倍。qPCR分析表明，細胞富集基因，包括CD34、VEGFR2、DLL4、CXCR4、EFNB2和IGF2，在GM90基質（圖1G）中顯著上升。同時，更硬的凝膠中芽的寬度更厚，矩陣中含有更多和長的纖維狀體（圖1H和I）。由此數據表明，基質硬度增加可以促進血管生成和細胞的形成。

圖1. 基質硬度增強血管生成和細胞在體外和體內的形成。

在EC球形發芽模型中，從球體中產生的外層細胞和以下細胞分別被定義為細胞和莖細胞。未爬出球體的細胞被定義為密集細胞（圖2A）。通過原子力顯微鏡（AFM），我們檢測到每個細胞的16個位置，并制作了典型的力學熱圖（圖2B）。細胞的剛度在數量上是莖細胞的兩倍，是咽細胞的四倍（圖2C）。此外，免疫熒光染色表明，細胞顯示長應力纖維的增強組裝，而在莖和密集細胞作用捆綁是相對較短的，并限制在細胞外圍（圖2D）。研究人員發現細胞中的YAT顯示出明顯的核定位，而YAT在咽細胞（圖2D和E）中成為細胞質。通過免疫熒光、多功能單細胞顯微操作系統FluidFM技術和原子力顯微鏡AFM，發現細胞擴散區域增加（圖3A），粘附力（圖3B和C）和細胞硬度（圖3D），這表明 EC-ECM 連接增加，并通過 ECM 硬化提升細胞機械特性。另外，VP（YEP抑制劑）治療顯著降低了EC球體的延伸次數和芽入侵距離（圖2F和G）。細胞富集基因也被VP（圖2H）抑制。因此，可以推斷基質硬度調節了ECs的細胞機械感知和機械傳輸，促進了YAC活化，終增強了細胞的形成。

圖2. 細胞、莖細胞和密集細胞的機械特性差異。

圖3. FluidFM粘附力檢測過程示意圖。

在確定了血管生成和細胞形成中EC亞型之間的機械差異后，作者探討了ECM剛度通過PXN磷化調節細胞的形成，驗證了 p-PXN 在硬 ECM 誘導細胞規范中的參與程度，進而推斷，通過基質硬化強加的細胞形成需要PXN磷酸化。隨后，作者驗證了p-PXN-Rac1-YAP激活在ECM僵硬誘導細胞形成和血管生成體內的作用，研究人員通過在裸鼠體內皮下注射 HepG2 細胞創建腫瘤模型，并從第 8 天起每天使用 VP 治療一次（圖4F）。4周后，在腫瘤膠囊（圖4G）上發現發芽較少的血管，CD31、CD34和VEGF強度（圖4H，圖4I ）。VP治療減少腫瘤體積（圖4J）。這些數據表明p-PXN-Rac1-YAP信號軸與ECM硬化促進的細胞形成和血管生成有很大關系。

圖4. p-PXN-Rac1 通過激活 YAP 促進細胞的形成和血管生成。

圖5. 發芽血管生成受ECM硬度影響的潛在機制的示意圖。

綜上，基質的硬度增加可以顯著增加血管的生長、發芽和細胞富集基因的表達。硬度較大的基質增加了FAK和p-PXN在局灶黏附，提高了活性Rac1的水平，進而導致細胞骨架組織和細胞剛度增加。隨后，YAP作為下游的力效應因子被激活并易位入核，上調靶基因的表達，終促進細胞的形成。

【研究意義】

本研究加深了我們對細胞形成和血管生成機理的理解，有助于優化組織工程和再生醫學的生物材料設計，為一些病理情況提供新的治療策略。無論是組織工程還是血管再生，都應考慮機械特性，如針對細胞形成的剛度，以設計佳功能生物材料。此外，ECM可以在許多病理狀態下變硬，如癌癥的發展過程，隨著變硬癌周圍細胞數量的增加，迫切需要靶向p-PXN、Rac1或YAP的藥物來有效防止腫瘤的生長和轉移。

【研究利器】——FluidFM技術在生物活性材料領域的創新應用

本實驗研究人員采用了多功能單細胞顯微操作系統——FluidFM技術，實現了單個細胞的分離，單個細胞粘附力的測量。瑞士Cytosurge公司多功能單細胞顯微操作系統——FluidFM，是集原子力系統、微流控系統、細胞培養系統為一體的單細胞操作系統。主要功能包括單細胞注射、單細胞提取、單細胞分離、單細胞粘附力的測定、生物3D打印等。實驗中FluidFM探針以3 μm/s靠近細胞，設定力為100 nN。當探針連接到到達設定點的細胞時，在探針中施加-650 mbar 的力，并保持5 s，以確保細胞被探針完全抓取。然后，在保持-650 mbar的壓力，以1 μm/s的速度將探針抬高至100 μm的高度，從而將細胞從基板上完全分離。FluidFM系統完全記錄了每個單細胞的Z軸高度和力距離曲線，并分析其粘附強度。每個條件下至少測量并獲得20個力距離曲線。所有細胞粘附測量實驗過程都是在 37 °C在5% CO2細胞培養環境下進行。

圖6. FluidFM進行單細胞分離示意圖。

圖7. FluidFM進行單細胞力譜測定示意圖。

【文末小視頻】

本研究實際DEMO視頻

【聯系方式】

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【參考文獻】

[1] Y. Guo, F. Mei, Y. Huang, S. Ma, Y. Wei, X. Zhang, M. Xu, Y. He, B.C. Heng, L. Chen & X. Deng. Matrix stiffness modulates tip cell formation through the p-PXN-Rac1-YAP signaling axis. (2021) Bioactive Materials.