- 2025-01-21 09:29:54蛋白質(zhì)和多肽
- 蛋白質(zhì)和多肽都是生物體內(nèi)重要的生物大分子。多肽是由多個(gè)氨基酸通過肽鍵連接而成的短鏈化合物，而蛋白質(zhì)則是由多肽進(jìn)一步折疊、組裝形成的復(fù)雜生物大分子。蛋白質(zhì)和多肽在生物體中扮演著至關(guān)重要的角色，如酶催化、結(jié)構(gòu)支持、信息傳遞、免疫防御等。它們是生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，對(duì)于維持生物體的正常生理功能具有重要意義。
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蛋白質(zhì)和多肽問答
- 2019-06-25 09:06:03蛋白質(zhì)和多肽反相HPLC分析和純化指南十
- 蛋白質(zhì)純化RP-HPLC 是一種有效的蛋白質(zhì)/多肽純化工具。 通過 RP-HPLC 法可以從雜質(zhì)中分離目標(biāo)蛋白/多肽，采集到的片段可用于進(jìn)一步研究，以及借助正交分析技術(shù)的分析，甚至可作為ZL藥物。 在蛋白質(zhì)/多肽分析過程中，色譜條件優(yōu)化的目標(biāo)是優(yōu)化分辨率和保留時(shí)間。 制備色譜法分離蛋白質(zhì)/多肽時(shí)，色譜條件的開發(fā)主要是三個(gè)參數(shù)的優(yōu)化（參見圖45）： 產(chǎn)量是從色譜法每一步中得到的純化的目標(biāo)蛋白/多肽含量。高產(chǎn)量可提高純化過程的實(shí)用性，并降低成本。 純度是從目標(biāo)產(chǎn)物中去除雜質(zhì)的程度。純度高有助于從后續(xù)分析中獲得更佳的數(shù)據(jù)或獲得高純度產(chǎn)物。 通量用來衡量制備周期中純化的物質(zhì)量。高通量說明在給定的成本和時(shí)間內(nèi)獲得更多研究或分析用物質(zhì)，或更多原料藥，用于制藥領(lǐng)域。 由于制備色譜的目的與分析色譜的目的不同，因此色譜條件優(yōu)化也不同。 圖45. 在蛋白質(zhì)或多肽的制備純化中，通過尋求產(chǎn)量、純度及通量的Z佳平衡實(shí)現(xiàn)分離條件的優(yōu)化。 樣品裝載在分析色譜中，將小樣品裝載到色譜柱上以確保加樣量不影響分辨率。 如果樣品量過高，則峰會(huì)加寬，進(jìn)而分辨率會(huì)下降。 在不發(fā)生峰展寬的情況下允許加載到色譜柱的樣品量（“樣品容量”）取決于柱的大小（附錄列表顯示了柱的大小和樣品容量）。 制備色譜法純化蛋白質(zhì)/多肽時(shí)，通常會(huì)超出樣品容量，使柱“過載”，從而增加產(chǎn)量和通量（圖46）。 當(dāng)允許一定的分辨率損失時(shí)，加載的樣品量可為樣品容量的10~50倍（附錄，Z大實(shí)際負(fù)載）。 圖46中，盡管由于柱過載使得峰變寬，但峰形相對(duì)較好，說明嚴(yán)重過載在增加產(chǎn)量的同時(shí)還能保持純度，但目標(biāo)蛋白/多肽的損失不可避免。 由于樣品過載，圖47中峰也同樣加寬。 片段收集、分析和利用當(dāng)柱過載時(shí)，通常會(huì)拋棄起始峰和結(jié)尾峰。 圖46中，對(duì)紅色區(qū)標(biāo)示的峰的中間區(qū)域進(jìn)行了收集。去掉了峰首和峰尾。 這避免了分離度較差的雜質(zhì)峰的收集，增加了純度，但降低了產(chǎn)量。 在制備色譜中，對(duì)幾種感興趣的峰進(jìn)行了片段收集，用于雜質(zhì)分析。 圖46.在多肽純化示例中，制備分離包括柱的過載加樣，以增加產(chǎn)量。 分辨率降低，為了增加純度必須拋棄峰首和峰尾，但產(chǎn)量稍微有所降低。 基于分析結(jié)果，收集了少雜質(zhì)或無雜質(zhì)的片段，拋棄了峰首和峰尾附近雜質(zhì)較多的片段。 收集和拋棄片段的選擇應(yīng)考慮純度和產(chǎn)量的平衡。 例如，在不損失分辨率的情況下，4.6 x 250 mm的“分析”柱可用于純化少量多肽（Z多約200微克）。 但為了增加產(chǎn)量和通量，同樣大小的柱Z多可純化10毫克，但會(huì)有一定的純度或產(chǎn)量損失。 恰當(dāng)?shù)氖占暹x擇有助于實(shí)現(xiàn)純度和產(chǎn)量間的Z佳平衡。 在制備色譜中，盡管ZD在樣品質(zhì)量，但樣品體積也可能會(huì)很大。 盡管可采用樣品環(huán)和注射器，但通過將樣品“泵”至柱上可以注入更多樣品。 將泵的吸入管置于樣品容器內(nèi)，樣品通過洗脫泵加載至色譜柱。 當(dāng)有機(jī)溶劑濃度低（通常，樣品裝在水相中）且目的蛋白/多肽以有機(jī)溶劑梯度洗脫時(shí)，可通過這種方式裝入大量樣品。 吸附劑粒徑分析色譜常用的吸附劑粒徑為5μm，制備色譜常用的吸附劑粒徑更大。 尤其是加樣量超過樣品容量時(shí)（柱過載），柱效較分析色譜影響較小。 當(dāng)柱過載時(shí)，大粒徑填充柱同小粒徑填充柱分離蛋白質(zhì)和多肽的效果一樣。 因此，制備色譜常用10μm或以上粒徑的吸附劑。粒徑分布也往往更寬。 不同于0.5μm或更窄的粒徑分布范圍，制備色譜的粒徑范圍更大，例如10~15μm。 由于制備色譜柱反壓和成本更低，因此更傾向于采用大粒子。 柱內(nèi)徑由于樣品容量很低，純化過程很少使用小孔柱（內(nèi)徑小于2mm）。 小規(guī)模實(shí)驗(yàn)室純化采用細(xì)孔柱（內(nèi)徑約2mm）和分析柱（4.6 mm內(nèi)徑）。 這種小規(guī)模制備分離的色譜條件通常與分析分離的色譜條件相同。 需要大量蛋白質(zhì)/多肽時(shí)，采用10mm和22mm內(nèi)徑的柱子。1 mg蛋白質(zhì)或多肽的純化可采用10 mm柱子，5 mg純化可采用22 mm柱子。 允許柱過載時(shí)，可純化更多蛋白質(zhì)/多肽，10mm柱Z多可純化50mg，22mm柱Z多可純化200mg。 大量蛋白質(zhì)或多肽的純化采用50 mm、100 mm或內(nèi)徑更大的大內(nèi)徑柱子。50mm內(nèi)徑的柱上已知Z多可純化5克蛋白質(zhì)/多肽。 柱長與分析柱相比，制備柱往往相對(duì)較短。 這是因?yàn)樵谥苽渖V法中，柱的總體積比柱長更重要，特別是蛋白質(zhì)的分離。 內(nèi)徑60cm、柱長12-15 cm（“圓餅狀”柱）的色譜柱已應(yīng)用到蛋白質(zhì)ZL藥物的大規(guī)模純化中。 由于在制備色譜法中，柱通常過載，且效益的重要性遠(yuǎn)不及產(chǎn)量、純度及通量重要，因此根據(jù)其實(shí)用性而非效益優(yōu)化柱尺寸。 流動(dòng)相組成同分析色譜法一樣，采用10~22mm內(nèi)徑柱的小規(guī)模純化常用乙腈-TFA體系。 大規(guī)模純化通常采用乙醇等溶劑替代乙腈，采用乙酸替代TFA。 盡管采用這些溶劑作流動(dòng)相會(huì)降低分辨率，但它們更適合大規(guī)模使用，且分辨率的降低與柱過載固有的分辨率損失相同 蛋白質(zhì)變性通常認(rèn)為反相色譜法會(huì)使蛋白質(zhì)變性，因此洗脫出來的蛋白質(zhì)不是天然蛋白，且可能不具備生物活性。 盡管反相HPLC的操作條件會(huì)使蛋白質(zhì)變性，但洗脫后仍可獲得天然、具有生物活性的蛋白質(zhì)。 有機(jī)溶劑可能減弱疏水力，造成蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的損失。吸附劑的疏水面也可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的去折疊。 但與色譜分離時(shí)間相比，蛋白質(zhì)去折疊通常較慢，且蛋白質(zhì)在反相色譜分離期間僅發(fā)生輕微變性。 由于二硫鍵的作用，蛋白質(zhì)保持球形結(jié)構(gòu)，且僅發(fā)生部分去折疊，因此從反相柱洗脫出的蛋白質(zhì)通常可通過在恰當(dāng)?shù)闹卣郫B緩沖液中處理，從而恢復(fù)其天然結(jié)構(gòu)而恢復(fù)至天然狀態(tài)。 目前有許多實(shí)例均顯示采用反相HPLC純化后的蛋白仍維持天然三級(jí)結(jié)構(gòu)和生物活性。 胰蛋白酶的反相純化，其中活性得到了保留，且隨后用于蛋白質(zhì)的胰蛋白酶酶切。 重組人紅細(xì)胞生成素是一種成功商業(yè)化的蛋白質(zhì)ZL藥物，采用了反相GX液相色譜法將蛋白藥物從其細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)系統(tǒng)中分離出來。 采用反相HPLC對(duì)另一種商業(yè)蛋白質(zhì)ZL藥物——粒細(xì)胞刺激因子進(jìn)行了純化。 此外，還采用反相HPLC對(duì)重組人胰島素進(jìn)行了純化，維持了活性結(jié)構(gòu)。 純化實(shí)例圖47顯示了合成肽——促性腺激素釋放激素（GnRH）拮抗劑的純化過程。該純化過程通過以下幾個(gè)步驟展開： 在4.6 x 250 mm 的分析柱上構(gòu)建洗脫條件。 在50 x 300 mm 的柱上裝載1.2克合成肽混合物，基于diyi步構(gòu)建的條件洗脫（圖47）。 對(duì) GnRH 拮抗劑各洗脫峰的片段進(jìn)行收集并借助分析法分析，Z終實(shí)現(xiàn)Z高產(chǎn)量和純度。 用乙腈和TFA作為洗脫劑，在反相色譜柱上再次進(jìn)行色譜分析,完成收集到片段的脫鹽處理。 收集片段實(shí)現(xiàn)Z高產(chǎn)量和純度。 在該色譜純化步驟中，從1.2 gm的反應(yīng)混合液中可收集128 mg的純化肽。 該純化過程采用了與分析色譜分離相同的有機(jī)溶劑——乙腈，但采用磷酸三乙胺替代了TFA。 由于柱過載，洗脫峰更寬，分辨率不如分析色譜。但峰仍然較為緊密，且容易收集到含目的多肽和GnRH的洗脫液。 圖47. 128mg的合成肽——促性腺激素釋放激素的純化。 柱嚴(yán)重過載，導(dǎo)致峰非常寬。 條件 色譜柱：C18寬孔柱，15~20μm粒徑，50 x 300 mm。 流動(dòng)相：乙腈和磷酸三乙胺水溶液梯度洗脫。 樣品：促性腺激素釋放激素
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- 2019-06-24 09:01:16蛋白質(zhì)和多肽反相HPLC分析和純化指南九
- 二硫鍵測(cè)定蛋白質(zhì)依靠正確的二硫鍵鍵合維持其三級(jí)結(jié)構(gòu)和生物活性。 如果二硫鍵被還原或交換，則蛋白質(zhì)會(huì)失去天然三級(jí)結(jié)構(gòu)和生物活性。 HPLC保留值取決于蛋白質(zhì)“疏水腳”的大小（圖41），它會(huì)受到三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。 二硫鍵的改變通常會(huì)使“疏水腳”增大，從而使蛋白質(zhì)在反相HPLC中的保留值增大。 圖42中，天然白細(xì)胞介素II的出峰遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于被還原的白細(xì)胞介素II，這是由于當(dāng)二硫鍵被還原時(shí)，蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。 圖41. 蛋白質(zhì)保留值取決于“疏水腳”的大小。被還原的二硫鍵會(huì)使蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生部分變性，這將增大“疏水腳”和反相保留值。圖42. 隨著二硫鍵的還原，白細(xì)胞介素II的“疏水腳”會(huì)增大，從而增加蛋白質(zhì)在反相HPLC上的保留值。條件色譜柱：C18 寬孔柱， 4.6 x 250 毫米流動(dòng)相：44.5%~50.8% 乙腈，以2 ml/min的流速進(jìn)行90分鐘的梯度洗脫樣品：白細(xì)胞介素II突變蛋白質(zhì)圖43. 對(duì)二硫鍵合正常和發(fā)生二硫鍵交換的類胰島素生長因子的分離。條件色譜柱：C4 寬孔柱， 4.6 x 250 毫米流動(dòng)相：20~38% 乙腈：異丙醇（88:12）—0.1% TFA體系，梯度洗脫，27分鐘。 即使是細(xì)微的二硫鍵改變也足以對(duì)疏水腳產(chǎn)生影響，從而改變保留值。 天然類胰島素生長因子（IGF）的Cys52和Cys47以及Cys48和Cys6之間都有二硫鍵（圖43A紅色部分所示）。 經(jīng)過36小時(shí)的空氣氧化，一些IGF蛋白分子內(nèi)出現(xiàn)了二硫鍵交換，變成了Cys52和Cys48以及Cys47和Cys6間的二硫鍵鍵合（圖43A藍(lán)色部分）。 發(fā)生了二硫鍵交換的IGF比天然IGF出峰晚（圖43），表明了疏水腳的增大。 天然蛋白的反相色譜法通常以反相保留值的變化揭示二硫鍵或蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。在蛋白酶水解蛋白過程中（通過省去DTT和羧甲基化過程），如果二硫鍵未被還原，則肽圖中仍會(huì)包含二硫鍵合的二肽。 分別比較二硫鍵未還原和還原的肽圖能夠確定二硫鍵的位置。 在二硫鍵還原和未還原條件下水解白細(xì)胞介素II，通過RP-HPLC法得到兩種水解產(chǎn)物的肽圖（圖44）。 圖44A中，以T7+T10標(biāo)記出的肽是一種二硫鍵合的二肽。 在二硫鍵被還原的條件下得到的肽圖顯示了兩種肽，分別為T7和T10（圖44B）。 這證實(shí)了二硫鍵存在于這兩種肽之間。 監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物肽能夠確定各個(gè)二硫鍵在蛋白質(zhì)中的位置。 如果一個(gè)胰蛋白酶肽段內(nèi)存在兩個(gè)半胱氨酸，則必須利用另一種蛋白酶確定參與到二硫鍵中的半胱氨酸。通常將肽圖分析和質(zhì)譜法聯(lián)用確定二硫鍵的位置和狀態(tài)。 圖44. 分別比較二硫鍵未還原（A圖）和還原（B圖）情況下白細(xì)胞介素II的肽圖。條件色譜柱：C18 寬孔柱， 4.6 x 250 毫米流動(dòng)相：5~80% 乙腈—0.1% TFA體系，混合梯度洗脫，99分鐘。樣品：A二硫鍵未還原情況下白細(xì)胞介素II的肽圖。B二硫鍵還原情況下白細(xì)胞介素II的肽圖。
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- 2019-06-21 09:25:19蛋白質(zhì)和多肽反相HPLC分析和純化指南八
- 脫酰胺作用 - 蛋白質(zhì)和多肽反相HPLC分析和純化指南蛋白質(zhì)在高溫或高pH值下會(huì)降解。 在脅迫條件下，Z有可能發(fā)生的化學(xué)降解是酰胺側(cè)鏈上的天冬酰胺轉(zhuǎn)變?yōu)樘於彼峄虍愄於彼幔▓D37)。 天冬酰胺脫去酰氨基時(shí)，許多蛋白都會(huì)失去生物活性，但也有部分蛋白的生物活性不受影響。 即使脫酰胺作用不造成生物活性的減弱，脫酰胺作用也是蛋白接觸不利條件的指示。 特定天冬酰胺殘基脫酰胺的可能性取決于其在蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)中的位置。 只有那些與溶劑接觸表面接近的天冬酰胺殘基才會(huì)發(fā)生脫酰胺作用。 相鄰的氨基酸殘基同樣影響脫酰胺作用的可能性。與天冬酰胺相鄰的甘氨酸極大地增加了脫酰胺作用的可能性。 與天冬酰胺相鄰的亮氨酸和異亮氨酸等大分子疏水性氨基酸降低了脫酰胺作用的可能性。 由于脫酰胺作用會(huì)影響生物活性并能指示不利條件，因此慣常的做法是監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)ZL藥物中天冬酰胺的脫酰胺作用。 圖37. 當(dāng)酰胺側(cè)鏈暴露在高溫和/或高pH條件下時(shí)，天冬酰胺轉(zhuǎn)化為天冬氨酸。 圖38. 人生長激素脫酰胺作用的反相色譜分析條件色譜柱：C4 寬孔柱， 4.6 x 250 毫米流動(dòng)相：29% 異丙醇，71% 10 mM Tris鹽酸緩沖液、pH=7.5這通常由反相GX液相色譜法實(shí)現(xiàn)。 圖38顯示了通過完整蛋白分子的反相色譜法測(cè)量人生長激素的脫酰胺作用的一個(gè)試驗(yàn)。 該試驗(yàn)pH為7.5，以使脫酰胺作用產(chǎn)生的天冬氨酸電離。 這使得脫酰胺的生長激素相較于天然蛋白疏水性減弱，從而比天然蛋白先洗脫出來。更常見的一種方法是通過肽圖中含天冬酰胺/天冬氨酸多肽的保留時(shí)間來測(cè)定脫酰胺作用。 在pH為2的肽圖中，含有天冬氨酸的脫酰胺肽的疏水性比含天冬酰胺的天然肽略強(qiáng)，因此比天然肽略晚洗脫出來，如圖39所示。 脫酰胺肽容易鑒別測(cè)定，為脫酰胺作用的判定提供了較好的方法。圖39. 部分脫酰胺的核糖核酸酶的肽圖條件色譜柱：C18 寬孔柱， 4.6 x 250 毫米流動(dòng)相：5%~38% 乙腈—0.1% TFA體系，混合梯度洗脫，100分鐘。有時(shí)，脫酰胺肽較難從天然肽中分離或會(huì)在肽圖中出現(xiàn)與其它肽的共洗脫峰。 如果分辨率不足，則可以增加pH。 如圖40所示，在低pH值下分離較差的脫酰胺肽能夠在6.5的高PH值下從天然肽中有效分離。 在部分脫酰胺的人生長激素的低pH肽圖中（圖40A），脫酰胺肽出峰稍晚于天然肽，但與肽圖中的另一種肽未分離。 對(duì)肽峰進(jìn)行收集后以更高的pH（pH6.5）重新進(jìn)行色譜分離。在高pH值下，脫酰胺肽中的天冬氨酸被電離，出峰早于含天冬酰胺的天然肽，且峰形好（圖40B）。圖40. 部分脫酰胺的人生長激素的肽圖中脫酰胺肽從天然肽的分離。A pH=2時(shí)，部分脫酰胺的hGH的肽圖（0.1% TFA）B 收集含天然肽（頂部）和脫酰胺肽（底部）的肽圖A中的肽段，在6.5的pH下重新進(jìn)行色譜分析。色譜柱：C4 寬孔柱， 4.6 x 250 毫米A. 流動(dòng)相：乙腈-0.1% TFA體系梯度洗脫，pH 2.0B. 流動(dòng)相：乙腈-30 mM 磷酸鈉體系梯度洗脫，pH 6.5
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- 2019-06-20 09:33:10蛋白質(zhì)和多肽反相HPLC分析和純化指南七
- 蛋白質(zhì)氧化 - 蛋白質(zhì)和多肽反相HPLC分析和純化指南在氧化環(huán)境條件下，盡管蛋白質(zhì)的幾個(gè)氨基酸都可能受影響，但Z有可能被氧化的氨基酸是甲硫氨酸；甲硫氨酸可被氧化成甲硫氨酸亞砜（圖34）。 對(duì)甲硫氨酸殘基的氧化取決于其在蛋白質(zhì)中的位置。埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的甲硫氨酸不可能被氧化。接近表面且與溶劑接觸的甲硫氨酸側(cè)鏈Z有可能被氧化。 氧化條件包括熱、過渡金屬的存在以及溶液中氧氣的存在。 同脫酰胺作用一樣，甲硫氨酸的氧化可能導(dǎo)致生物活性的喪失或減弱，或者，在一些情況下對(duì)生物活性無影響。 這取決于甲硫氨酸在蛋白質(zhì)中的位置。但另一方面，甲硫氨酸亞砜的存在說明蛋白質(zhì)經(jīng)受過氧化條件，因此甲硫氨酸氧化可以指示蛋白質(zhì)經(jīng)受過脅迫條件。 圖34. 在氧化環(huán)境條件下，甲硫氨酸被氧化為甲硫氨酸亞砜。 圖35. 天然蛋白水解產(chǎn)生的重組人凝血因子VIIa的一氧化物和二氧化物的反相色譜法分離。 條件色譜柱：C4 寬孔柱， 4.6 x 250 毫米流動(dòng)相：37~47% 乙腈-0.1% TFA體系，30分鐘梯度洗脫。樣品：被過氧化氫部分氧化的重組人凝血因子 VIIa。通常會(huì)監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)ZL藥物的氧化反應(yīng)，因?yàn)樗瓤赡苡绊懮锘钚裕部勺鳛橐环N指示。 甲硫氨酸的氧化反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)疏水性下降，因此在反相HPLC中，氧化蛋白會(huì)先于天然蛋白洗脫出來，如圖35所示。 重組人凝血因子VIIa（rCF VIIa）被過氧化氫部分氧化后利用反相HPLC對(duì)溶液進(jìn)行分析。 氧化蛋白（兩個(gè)甲硫氨酸殘基被氧化）先洗脫出來。 只有一個(gè)甲硫氨酸被氧化的兩種蛋白隨后洗脫出來，Z后是天然蛋白。四種蛋白具有良好的分辨率。 尤其是只有一個(gè)甲硫氨酸被氧化的兩種蛋白間分辨率很高。這幾種蛋白均有一個(gè)氧化甲硫氨酸，僅區(qū)別于被氧化甲硫氨酸的不同。通常利用肽圖監(jiān)測(cè)甲硫氨酸的氧化。 如圖36所示，含氧化甲硫氨酸的多肽比含天然甲硫氨酸的多肽出峰時(shí)間早很多。T2 metox 先于天然T2胰蛋白酶水解片段洗脫出來；T11 metox先于天然 T11洗脫出來，使得鑒別和監(jiān)測(cè)更容易。圖36. 部分氧化的人生長激素的肽圖。 條件色譜柱：C18寬孔柱，4.6 x 250 mm流動(dòng)相：0~40% 乙腈—0.1% TFA體系，梯度洗脫，120分鐘。
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- 2019-06-19 15:32:41蛋白質(zhì)和多肽反相HPLC分析和純化指南六
- 肽圖分析法 - 蛋白質(zhì)和多肽反相HPLC分析和純化指南反相GX液相色譜已成為蛋白質(zhì)分析和表征的標(biāo)準(zhǔn)方法，尤其是ZL性藥物的分析和表征。 反相色譜分析法分辨率高，檢測(cè)靈敏度好，能夠提供大量關(guān)于蛋白質(zhì)的信息。 有些時(shí)候，蛋白質(zhì)作為完整的分子分析，但更多的時(shí)候采用蛋白水解酶作用于特殊的氨基酸殘基將碳骨架斷開，從而將蛋白質(zhì)裂解成小片段。 隨后用反相GX液相色譜法對(duì)裂解產(chǎn)生的肽段進(jìn)行分析。 該技術(shù)叫作肽圖分析，是一種標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)分析方法。通過反相色譜分析蛋白質(zhì)裂解后的肽段能夠獲得蛋白質(zhì)的大量信息。通過比較表達(dá)蛋白與參照標(biāo)準(zhǔn)蛋白的肽圖能夠得出蛋白純度和表達(dá)的準(zhǔn)確性。肽圖通常作為蛋白質(zhì)ZL藥物的鑒定分析工具。 通過肽圖可以確定蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物，如發(fā)生脫酰胺作用的天冬酰胺和氧化甲硫氨酸。肽圖可以確認(rèn)或驗(yàn)證二硫鍵連接，以此得出蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)和LX。肽圖能夠確定糖基化（加入碳水化合物）位點(diǎn)，為詳細(xì)鑒定連接在其上的寡糖提供了條件。利用質(zhì)譜檢測(cè)得到的肽圖為蛋白質(zhì)鑒定、肽序列分析和數(shù)據(jù)確認(rèn)提供了一種先進(jìn)的手段。在生物蛋白質(zhì)組研究中，蛋白酶水解產(chǎn)物還用于蛋白質(zhì)的鑒定和定量分析。 有許多蛋白水解酶都能斷開蛋白質(zhì)的碳骨架，通常作用于特殊氨基酸殘基。包括： 蛋白酶特異性特性胰蛋白酶作用于賴氨酸和精氨酸的羧基端平均每10~12個(gè)氨基酸產(chǎn)生一個(gè)肽。胰蛋白酶是Z常用的蛋白水解酶。胞內(nèi)蛋白酶 Lys-C作用于賴氨酸的羧基端能夠產(chǎn)生胰蛋白酶水解蛋白生成多肽的60~70%。Lys-C 的優(yōu)點(diǎn)是在高達(dá)4M的尿素濃度中仍能保持活性。S.aureus V8 蛋白酶作用于酸性氨基酸和天冬氨酸的羧基端。為胰蛋白酶水解法提供補(bǔ)充信息。胞內(nèi)蛋白酶 Asp-N作用于天冬氨酸的羧基端為胰蛋白酶水解法提供補(bǔ)充信息。 胰蛋白酶是Z常用的蛋白水解酶（蛋白酶）。以下為胰蛋白酶水解蛋白的五個(gè)階段：（注：參考文獻(xiàn)21詳細(xì)回顧了胰蛋白酶的水解） 變性。要在合理的時(shí)間內(nèi)完成蛋白質(zhì)水解，必須對(duì)蛋白質(zhì)作變性處理。高溫下（37℃），將蛋白質(zhì)置于6M 鹽酸胍或8M 尿素等離液劑中，在中性pH值（~7.5）緩沖液下處理30分鐘，蛋白質(zhì)即可變性。二硫鍵的還原。二硫鍵會(huì)阻止蛋白質(zhì)的完全變性。 通常可通過在待水解蛋白的變性過程中加入濃度為~20 mM 的二硫蘇糖醇（DTT）等還原劑將二硫鍵還原。游離半胱氨酸的羧甲基化。如果還原性半胱氨酸保持游離狀態(tài)，則有可能以錯(cuò)誤的方式重新形成二硫鍵。為了避免這種情況，可加入濃度為~60mM的碘乙酸等試劑，在37℃溫度下處理30分鐘，使游離半胱氨酸甲基化。該反應(yīng)由100 mM DTT 退火。脫鹽。當(dāng)溶液中存在尿素或胍鹽時(shí)，水解反應(yīng)無法進(jìn)行，因?yàn)橐鹊鞍酌缸陨碜鳛橐环N蛋白質(zhì)會(huì)變性，失去酶活性。 尿素或胍鹽必須通過離子交換或滲析去除或?qū)舛冉档椭?M以下。胰蛋白酶水解。脫鹽后，將蛋白質(zhì)溶解在pH7.5~8.5（胰蛋白酶的Z高活性pH）的緩沖液中——Tris或碳酸銨，并在20~100個(gè)待水解蛋白組分中加入一份胰蛋白酶，隨后在低溫至37℃的溫度區(qū)間內(nèi)處理蛋白質(zhì)。 低溫處理時(shí)間長達(dá)16個(gè)小時(shí)。在37℃下，水解可在1~4小時(shí)內(nèi)完成，具體取決于蛋白質(zhì)。如果胰蛋白酶的時(shí)間、溫度或相對(duì)濃度均過低，則水解將不完全，一些潛在裂解可能不發(fā)生，Z終導(dǎo)致形成含賴氨酸或精氨酸的大分子肽。 如果胰蛋白酶的水解時(shí)間、溫度或濃度均過高，則會(huì)發(fā)生胰蛋白酶自身溶解，產(chǎn)生“自溶產(chǎn)物”，即胰蛋白酶水解產(chǎn)生的肽段，從而造成混淆。 慣常的做法是忽略蛋白質(zhì)，考慮胰蛋白酶。按照蛋白質(zhì)完全水解的條件對(duì)得到的樣品進(jìn)行色譜分析，了解胰蛋白酶自溶的程度以及肽圖中任何胰蛋白酶自溶肽產(chǎn)物的位置。 開發(fā)胰蛋白酶水解協(xié)議過程中，對(duì)胰蛋白酶和蛋白質(zhì)的水解時(shí)間、溫度和相對(duì)濃度進(jìn)行了優(yōu)化。當(dāng)利用肽圖確定二硫鍵的位置時(shí)，必須在不還原二硫鍵的情況下水解蛋白。但在二硫鍵未被還原的情況下，許多蛋白質(zhì)的水解速度非常慢。在缺還原劑的情況下，如果水解速度很慢或水解不佳，可利用Lys-C代替胰蛋白酶，并在4M尿素中水解，維持水解過程中蛋白質(zhì)的變性。 水解過程中有時(shí)采用表面活性劑維持溶液中的蛋白質(zhì)，但表面活性劑會(huì)降低色譜分辨率，應(yīng)盡量避免。 胰蛋白酶水解分析。蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的肽段利用反相GX液相色譜分析，流動(dòng)相采用含TFA體系（參見第15-17頁），以起始濃度約5%的乙腈梯度洗脫（乙腈起始濃度低于5%可能導(dǎo)致較早洗脫出肽的色譜的不可重現(xiàn)性），乙腈濃度逐漸升至70%（參見圖31）。 梯度洗脫的時(shí)間取決于待水解蛋白的大小。 大分子蛋白比小分子蛋白水解產(chǎn)生更多的肽段，因此肽段的分離需要更長洗脫時(shí)間。 小分子蛋白（小于20kd）水解產(chǎn)生的肽通常可在45~60分鐘內(nèi)完成分離。 大分子蛋白（20-50kd）需要較長的洗脫時(shí)間，一般為60~120分鐘。 分子量大于50kd的蛋白質(zhì)需要120~180分鐘的洗脫時(shí)間。 采用1~2 ml/min 的流速和適宜的溫度時(shí)分辨率Z佳。通常采用C18 反相柱。可以使用孔徑為100埃或300埃的柱子，其選擇性通常不同。圖31. 牛血清白蛋白的肽圖 色譜柱：ACE 5 C18-300 寬孔柱，4.6 x 150 mm 流動(dòng)相：4%~70%乙腈-0.1% TFA 體系，混合梯度洗脫120分鐘。 蛋白質(zhì)修飾引起肽保留時(shí)間的變化。如果蛋白質(zhì)因翻譯或表達(dá)錯(cuò)誤，降解（脫酰胺作用、氧化反應(yīng)）或過程變異而改變，則這種改變將會(huì)反映在一種或多種肽段。 由于與肽的反相相互作用的靈敏度，肽的任何變化都將導(dǎo)致該肽保留時(shí)間的變化。 在圖32示例中，相差一個(gè)氨基酸的兩種十肽，其中一個(gè)為蘇氨酸，另一個(gè)為絲氨酸，在反相HPLC圖譜中出現(xiàn)了兩個(gè)峰。 不僅僅是一個(gè)氨基酸的差別，而且兩種氨基酸均為羥基氨基酸，它們的不同之處在于蘇氨酸側(cè)鏈上加了一個(gè)甲基。 這說明了蛋白質(zhì)的任何變化都會(huì)反映為肽的變化，從而導(dǎo)致該肽保留時(shí)間的改變。 肽圖分析的本質(zhì)是反相HPLC能夠?qū)崿F(xiàn)差別細(xì)微的多肽的分離。圖32. 以RP-HPLC對(duì)緊密關(guān)聯(lián)的肽類進(jìn)行分離。 僅有一個(gè)氨基酸不同的兩種十肽菌素，一種含絲氨酸，而另一種含蘇氨酸。條件色譜柱：C18 寬孔柱， 4.6 x 250 毫米洗脫液：A. 含有0.1%三氟乙酸的水溶液B. 含有0.08%三氟乙酸的乙腈溶液梯度：0 - 35%的B溶液超過73分鐘 試樣肽圖與參照蛋白質(zhì)肽圖的比較。肽圖能夠提供有關(guān)蛋白質(zhì)的很多信息。 慣常做法是對(duì)試樣的肽圖和參照蛋白質(zhì)的肽圖進(jìn)行比較。 圖33對(duì)重組人生長激素（在大腸桿菌中表達(dá)）的肽圖和天然人生長激素（缺乏甲硫氨酸）的肽圖進(jìn)行了比較。 由于甲硫氨酸的疏水性質(zhì)，重組人生長激素比天然人生長激素較晚洗脫出來。 在這個(gè)例子中，為了便于比較，將第二幅圖譜倒置顯示。 在一些情況下，為了確認(rèn)微小的變化和證明分析工具與肽圖的變化無關(guān)，會(huì)將兩種水解產(chǎn)物混合進(jìn)行色譜分析。肽圖比較揭示了蛋白質(zhì)的改變和修飾，如：基因改變、翻譯錯(cuò)誤、蛋白降解（脫酰胺作用、氧化反應(yīng)），以及翻譯后修飾的改變。圖33. 重組人生長激素和天然人生長激素（缺乏甲硫氨酸）肽圖的比較。條件：色譜柱：C18寬孔柱，4.6 x 150 mm流動(dòng)相：0~70% 乙腈-0.1% TFA 體系梯度洗脫
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