產品簡介

 

外泌體純化柱試劑盒適用于澄清度高的非復雜生物樣本（如細胞上清、牛奶澄清液等）中外泌體囊泡的分離和純化。純化柱采用尺寸排阻技術，根據顆粒的大小在顆粒通過裝有多孔多糖樹脂的柱子時對其進行分離。當樣品在重力作用下通過純化柱時，大顆粒首先流出，小顆粒則在下行過程中進入樹脂孔，延遲流出。純化柱體積由固體樹脂（固定相）和液體緩沖液（流動相）占據。顆粒不與樹脂發生化學結合，保證分離穩定性和可重復性。該試劑盒具有快速、高效、獲得的外泌體純度高等特點，可用于電鏡分析、NTA粒徑分析、核酸分析、蛋白分析、細胞學實驗和動物實驗等。

特別注明：本試劑盒僅為外泌體純化試劑盒，非濃縮試劑盒，需購買外泌體提取試劑盒或采用其他方式對樣本進行濃縮前處理。

 

組分信息

 

組分編號	組分名稱	41218ES05
41218-A	純化柱	5 T
41218-B	適配器	5 T
41218-C	再生液	300 mL
41218-D	Exosome Purification Column	25 T

 

儲存條件

 

室溫運輸，本試劑盒可于室溫穩定保存12個月。

 

使用說明

 

1. 樣品制備

單次上樣體積：0.5 mL，上樣前平衡至室溫。

1）濃縮：建議使用細胞培養上清外泌體快速抽提試劑盒、乳液外泌體快速抽提試劑盒對樣品進行100倍以上濃縮，或采用超離、切向流、100 kD超濾等方式，進行50倍以上濃縮。

注：謹慎使用超離，可能導致蛋白聚團影響分辨率。

2）推薦BCA濃度：含10%去外泌體血清的細胞上清粗提外泌體BCA濃度大于3 μg/μL，無血清細胞上清粗提外泌體BCA濃度大于1 μg/μL，乳液粗提外泌體BCA濃度大于3 μg/μL。

注：純化柱的主要作用為去除蛋白和游離核酸等小顆粒物質，純化過程會對樣本進行一定的稀釋，因此應盡量保證樣品中有足夠多的囊泡。如需拍攝電鏡，原樣顆粒數濃度建議大于8.0E+10 particles/mL。

2. 樣品預處理

1）使用推薦方法濃縮樣品。

2）過濾：使用0.22 μm濾膜去除粗提外泌體中的大顆粒。

注：經Exosome Purification Column（EP柱）純化后的樣品無需再使用0.22 μm濾膜過濾。

3）準備PBS：使用新過濾的PBS（0.22 μm）以避免污染和引入大顆粒，確保PBS的溫度與柱子相同（18 - 25℃）。

注：盡量使用當天新配的經過0.22 μm濾膜過濾的PBS，或采購已過膜的PBS，避免引入微生物及顆粒物污染。如果使用4℃冰箱保存的PBS溶液，必須平衡到室溫后再用，否則有可能在柱子中引入大量氣泡，影響分離效果。

3. 柱平衡與清洗

1）實驗前確保純化柱處于18 - 25℃的操作溫度范圍內，在達到操作溫度范圍之前，請勿取下柱蓋。

2）先取下頂蓋上黑色橡膠帽，平衡氣壓后，再取下頂蓋。

3）將純化柱垂直安裝到鐵架臺上，將廢液收集管（離心管或者燒杯均可）放置于柱下方，以備使用。

4）棄去篩板上方的填料保存液（取下底蓋，待填料保存液自然流盡或用移液器吸去）。

5）填料保存液流盡后，使用PBS對純化柱的上室進行2 - 3次洗滌，隨后加入20 mL PBS清洗柱內填料（可分次加，也可連接適配器，每毫升PBS流穿時間約1.5 - 2.5 min）。當所有PBS都進入柱內，液體將停止流出。

注：適配器的使用方式：綠色適配器上方連接20 mL規格注射器針筒。

6）PBS流盡后直接上樣，或加入2 mL PBS蓋上底蓋備用。

注：若使用適配器，待針筒中PBS流盡，柱內剩余約2 - 3 mL緩沖液，可取下適配器，等待剩余PBS流盡，隨即進行上樣或加入2 mL PBS蓋上底蓋備用。

4. 外泌體搜集

1）上樣前準備：使用推薦方法濃縮并過濾樣本，準備若干標注好的1.5 mL EP管待用。

2）加入0.5 mL樣品：一旦PBS不再流出，立即將室溫平衡好的0.5 mL樣品加至純化柱篩板上（若樣品不足0.5 mL，用PBS補足）。

注：避免在過程中長時間停止柱流，確保囊泡分離效果。

3）流穿2.87 mL緩沖液（空隙體積）：當所有樣品都進入篩板，底部出口無液體流出后，加入2.37 mL PBS，等待PBS流過直至無液體流出。此過程中，共流出緩沖液體積2.87 mL（0.5 mL樣品體積+2.37 mL緩沖液）

注：為準確確定流穿體積，僅加入固定體積溶液，等待其流過直至流動停止。

4）收集外泌體餾分：立即用新的EP管準備收集純化體積，分次在篩板上方加入0.5 mL PBS，按0.5 mL/餾分收集2 - 3個餾分（純度最佳為前2個餾分即1 mL體積，推薦合并前3個餾分即1.5 mL體積），每次等待體積流過直至流動停止。

5）過濾外泌體：將收集的外泌體餾分轉入Exosome Purification Column（EP柱）上室中，于4℃以3,000×g離心10 min，離心后收集EPF柱管底的液體，此液體即為過濾的外泌體（注：EP柱不可重復使用）。

6）測定收集產物的顆粒濃度和蛋白濃度。如需要，可使用100kD超濾管對收集產物進行進一步濃縮富集（選做）。

5. 柱再生和儲存

1）柱再生：收集到所需體積后，用10 mL再生液進行清洗，再用20 mL PBS清洗，隨后可進行第二次上樣。

2）柱儲存：如果要儲存以備將來使用，先用10 mL再生液進行清洗，再依次用20 mL PBS、20 mL去離子水和20 mL的20%乙醇清洗，清洗結束后蓋上底蓋，倒入保存液（20%乙醇），蓋上頂蓋密封儲存。

注：再生液為堿性，避免再生液清洗后直接添加去離子水或20%乙醇來平衡純化柱，防止樹脂床內的鹽沉淀并損壞柱。

去離子水清洗可進一步洗去平衡過程中產生的鹽，防止鹽與20%乙醇直接接觸產生結晶。

可按每毫升液體流穿需1.5 - 2.5 min估算各步驟清洗時間，避免柱內液體流盡后，填料干放時間過長。

 

注意事項

 

1. 當外泌體餾分用于后續高通量測序或者其他組學分析時，為避免交叉污染，建議使用新柱。
2. 再生過程中不可避免會產生鹽，鹽沉淀影響填料性能，每根柱子重復使用次數建議不超過5次。
3. 請注意使用過程中勿將柱子從高處摔落或摔打，以免導致柱床碎裂。
4. 再生液為堿性，有一定腐蝕性，請務必小心使用！
5. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
6. 本產品僅作科研用途！

 

 

Ver.CN20241027