產品簡介

 

rProtein A/G免疫沉淀磁珠使用“納米表面生物技術”(S-TEC)，將rProtein A/G高密度定向包被到粒徑為200 nm的納米磁珠表面，納米級磁珠提供的超大比表面積，具有更多的結合位點、更高的抗體結合能力和極低的蛋白非特異性吸附率，一步純化即可從血清樣品中分離出純度>90%的抗體，使用簡便有效。

天然蛋白A（Protein A）是一種發現于金黃色葡萄球菌的細胞壁表面蛋白，天然蛋白G（Protein G）是一種分離自G型或C型鏈球菌屬的細胞表面蛋白，二者功能相似，主要通過與免疫球蛋白（Ig）的Fc區相互作用，可結合大多數哺乳動物的IgG，但在兩者結合特異性上有所不同。rProtein A/G免疫磁珠同時共價偶聯了蛋白A和蛋白G，比單獨的蛋白A或者蛋白G都有更廣的結合范圍，實用性更高。同時，本品使用的是基因改造后的蛋白A和蛋白G，不僅維持其本身的Ig親和特性，同時也去除了天然蛋白本身的非主要結合域以降低非特異性結合。本品適用的范圍廣泛，可應用于細胞裂解液、細胞分泌液上清、血清、動物腹水以及其它的免疫抗原等樣本。

另外我司亦提供rProtein A/G IP/Co-IP Kit 蛋白A/G免疫（共）沉淀試劑盒（Cat#36421ES）, 包含足夠完成40個反應的試劑，每個反應使用25 uL磁珠，同時可進行10個陰性對照。

翌圣為您提供蛋白純化實驗整體解決方案，相關產品選購請參考：蛋白純化系列產品-選購指南

 

產品性質

 

基質（Matrix  spherical）	硅基磁珠
配體（Ligand）	重組蛋白A/G
結合能力（Binding Capacity）	≥0.7 mg hIgG /mL磁珠
粒徑（Particle size）	200 nm
磁珠濃度（Concentration）	10 mg/mL
應用（Application）	IP、COIP、CHIP、RIP等

 

儲存條件

 

2~8℃保存，有效期2年。

 

使用說明

 

工作液濃度應根據具體實驗確定，建議進行預實驗摸索最佳實驗濃度。

1. 緩沖液配制

【注】建議以下緩沖液在使用前用 0.22 μm 或 0.45 μm 濾膜過濾。

裂解緩沖液：0.15 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, 1% NP-40, pH7.4或WB/IP裂解液（Cat#20118ES）

平衡/結合/洗雜緩沖液：0.15 M NaCl, 20 mM Na₂HPO₄, pH7.0

交聯緩沖液：0.2 M 三乙醇胺，pH8.2

中和緩沖液：1 M Tris-HCl，pH 8.5

洗脫緩沖液：0.1 M甘氨酸，pH 3.0

交聯劑：DMP(Dimetyl pimelimidate dihydrochloride)

終止液：50 mM Tris-HCl，pH 7.5

2. 抗原樣品制備

本操作說明書提供以下四種樣品處理方法，建議您根據不同來源的抗原樣品選擇適當的方式進行預處理，使待檢測抗原釋放至樣品溶液中。

血清樣品處理：若目標蛋白豐度較高， 建議用結合緩沖液稀釋血清樣品至目標蛋白終濃度為10-100 µg/mL，置于冰上備用(或置于-20℃長期保存)。

懸浮細胞樣品處理：離心收集細胞（4℃, 1000g, 5 min），用手指把細胞用力彈散。按照6孔板每孔細胞加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制劑的裂解液（裂解液應在使用前數分鐘內加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1 mM）。混勻后置于冰上處理10 min；離心收集上清液（4℃, 14000g, 10 min），置于冰上備用（或置于-20℃長期保存）。

貼壁細胞樣品處理：移去培養基，用PBS清洗細胞兩遍；用細胞刮棒刮脫細胞，收集至1.5mL EP管內，按照6孔板每孔加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制劑的裂解液（裂解液應在使用前數分鐘內加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1 mM）。用槍吹打數下，使裂解液和細胞充分接觸。混勻后置于冰上處理10 min；離心收集上清液（4℃, 14000g, 10 min），置于冰上備用（或置于-20℃長期保存）。

大腸桿菌樣品處理： 離心收集大腸桿菌（4℃, 12000g, 2 min），棄上清后稱重， 按每克（濕重）菌體10 mL的比例用1×PBS洗滌2次；按每克（濕重）菌體5-10 mL的比例加入結合緩沖液，同時加入蛋白酶抑制劑，重懸菌體，超聲裂解細胞，離心收集上清（4℃, 17000g, 10 min）。

3.  磁珠預處理

1. 將磁珠漩渦振蕩1 min，使其充分混懸；
2. 取50 µL磁珠懸液置于1.5 mL EP管中，放置在磁分離器上，待溶液變澄清后，用移液器吸棄保護液。
3. 將EP管從磁分離器上取下來，加入200 µL結合緩沖液洗滌，進行磁性分離，吸棄上清，重復洗2次。

4.  抗體吸附

1)  加入目標抗體溶液（5-25 µg抗體總量），充分混勻，體積不足500 µL時用平衡液補足。

2)  室溫孵育 10 min以上（具體時間根據結合效果調整），可以振蕩或漩渦混合均勻。

3)  將EP 管置于磁分離器上，待磁珠全部吸附后，吸棄上清液。如需要可留做進一步檢測。

4)  加入500 μL 洗雜液混合均勻，置于磁分離器上，待磁珠全部吸附后，吸棄上清液。重復洗雜至少 3次。 

5.  抗體交聯 (備選)

1）如果需要將抗體和目標抗原復合物共同洗脫，請忽略本步驟，直接進行操作6。 50μL-1mL 磁珠量均可以按照以下步驟操作，無需額外增加交聯液體積。

2）加入 1 mL交聯液，振蕩懸浮，置于磁分離器上，大約1 min，待溶液變澄清后，吸棄上清液。該操作重復兩次。

3）再加入1 mL含有20 mM DMP（dimetylpimelimidate dihydrochloride）的交聯液， 此試劑需要現用現配。振蕩懸浮，在室溫下置于翻轉混合儀或者手工輕輕翻轉離心管， 促使溶液和磁珠充分接觸，約30 min后，置于磁分離器上，大約 1 min，待溶液變澄清后，吸棄上清液。

4）使用1 mL終止液懸浮磁珠，終止交聯反應，在室溫下置于翻轉混合儀或者手工輕輕翻轉離心管，促使溶液和磁珠充分接觸，約15 min后，置于磁分離器上，大約 1 min，待溶液變澄清后，吸棄上清液。

5）加入1 mL平衡液，顛倒混勻，置于磁分離器上，大約 1 min，待溶液變澄清后，吸棄上清液。再重復兩次。 

6.  抗原結合反應

1)  加入含有抗原的樣品（通常100-1000 μL)，用移液器輕輕吹打使抗原與磁珠-抗體復合物均勻分散。

2)  在室溫下置于翻轉混合儀或者手工輕輕翻轉離心管 10 min，使抗原與抗體充分結合，如結合力較弱則可在室溫下反應1h或者在4℃下反應過夜。

3)  上述完成抗原吸附的磁珠-抗體-抗原復合物進行磁性分離，收集上清液，以備后續檢測。

4)  向離心管中加入1 mL洗雜液，用移液器輕輕吹打使磁珠-抗體-抗原復合物均勻分散，然后進行磁性分離，棄上清液；從磁分離器上取下離心管，再重復洗滌兩次。

 7．抗原洗脫

A. 變性洗脫 此方法洗脫的樣品適用于SDS-PAGE檢測。

1) 從磁分離器上取下離心管，向其中加入80-100 μL 1×SDS-PAGE Loading Buffer 混合均勻， 95℃加熱 10 min。

2) 置于磁性分離器上，進行磁性分離，或者離心，收集上清液進行SDS-PAGE檢測。

B. 非變性洗脫

1) 向磁珠-抗體-抗原復合物中加入300 μL洗脫液，混合均勻，室溫孵育10 min。

2) 置于磁性分離器上，進行磁性分離，收集洗脫液至新的 EP 管中。

3) 重復步驟 1）和2），收集洗脫液，與2）中洗脫液混合，加入中和液中和至 pH7.0-8.0。

 

注意事項

 

1. 本產品僅作科研用途。

2. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。

Ver.CN20240730