細胞培養(yǎng)常見問題的原因及解決方法

　　1. 培養(yǎng)液pH值變化太快：

　　CO2張力不對。培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊。NaHCO3緩沖系統(tǒng)緩沖力不足。培養(yǎng)液中鹽濃度不正確。細菌、酵母或真菌污染。

　　按培養(yǎng)液中NaHCO3濃度增加或減少培養(yǎng)箱內(nèi)CO2濃度，2.0g/L到3.7g/L濃度NaHCO3對應CO2濃度為5%到10%。(2)改用不依賴CO2培養(yǎng)液。

　　松開瓶蓋1/4圈。

　　加HEPES緩沖液至10到25mM終濃度。

　　在CO2培養(yǎng)環(huán)境中改用基于Earle’s鹽配制的培養(yǎng)液，在大氣培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)改用Hank’s鹽配制的培養(yǎng)液。

　　丟棄培養(yǎng)物或用抗生素除菌。

　　2. 培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀，但pH值不變：

　　用洗滌劑清洗后殘留磷酸鹽將培養(yǎng)基成分沉淀下來。冰凍保存培養(yǎng)液。

　　用去離子水反復沖洗玻璃器皿，然后除菌。

　　將培養(yǎng)液加熱到37℃，搖動使其溶解如沉淀仍然存在，丟棄培養(yǎng)液。

　　3. 培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀，同時pH 發(fā)生變化：

　　細菌或真菌污染。

　　丟棄培養(yǎng)物或用抗生素除菌。

　　4. 培養(yǎng)細胞不貼壁：

　　胰蛋白酶消化過度;支原體污染;培養(yǎng)液中無貼壁因子。

　　縮短胰蛋白酶消化時間或降低胰蛋白酶濃度。

　　分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。

　　5. 懸浮細胞成簇：

　　培養(yǎng)液中含鈣、鎂離子。支原體污染。蛋白酶過度消化使得細胞裂解釋放DNA。

　　用無鈣鎂平衡鹽溶液洗滌細胞，輕輕吹吸細胞獲得單細胞懸液。

　　分離培養(yǎng)物，檢測支原體。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。

　　用DNase I處理細胞。

　　6. 原代細胞培養(yǎng)物污染：

　　原代培養(yǎng)組織在進入培養(yǎng)前已污染

　　培養(yǎng)前用含高濃度抗生素的平衡鹽溶液反復沖洗組織。

　　7. 培養(yǎng)細胞死亡：

　　培養(yǎng)箱內(nèi)無CO2。培養(yǎng)箱內(nèi)溫度波動太大。細胞凍存或復蘇過程中損傷。培養(yǎng)液滲透壓不正確。培養(yǎng)液種有毒代謝產(chǎn)物堆積。

　　檢測培養(yǎng)箱內(nèi)CO2

　　檢查培養(yǎng)箱內(nèi)溫度

　　取新的保存細胞種

　　檢測培養(yǎng)液滲透壓。注意：大多數(shù)哺乳動物細胞能耐受滲透壓為260–350mOsm/kg。加入額外試劑如HEPES或藥物都有可能影響培養(yǎng)液滲透壓。

　　換入新鮮培養(yǎng)液

　　8. 培養(yǎng)細胞生長減慢：

　　由于更換不同培養(yǎng)液或血清。培養(yǎng)液中一些細胞生長必需成分如谷氨酰胺或生長因子耗盡或缺乏或已被破壞。培養(yǎng)物中有少量細菌或真菌污染。試劑保存不當。

　　比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細胞生長實驗。

　　增加起始培養(yǎng)細胞濃度。

　　讓細胞逐漸適應新培養(yǎng)液。

　　換入新鮮配制培養(yǎng)液。

　　補加谷氨酰胺或生長因子。

　　用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，丟棄培養(yǎng)物。或用抗生素除菌。

　　血清需保存在-5℃ 到-20℃。培養(yǎng)液需在2–8℃避光保存。含血清培養(yǎng)液在2–8℃保存，并在2周內(nèi)用完。

　　接種細胞起始濃度太低，細胞已老化，支原體污染。

　　增加接種細胞起始濃度。

　　換用新的保種細胞。

　　分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。

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