首先采集健康供體的血液細(xì)胞，用密度梯度離心法分離健康人血中的外周血單核細(xì)胞 PBMC 細(xì)胞。

在體外，作者利用 1μg/mL CEF 肽庫（CTL Eu-rope GmbH）處理來自健康供體樣品的總 PBMC，結(jié)合 MHC-I 分子，活化特異性 CD8+ T 細(xì)胞，并用 IL7（5ng/mL）和 IL2（20UI/mL）細(xì)胞因子培養(yǎng)細(xì)胞 14 天。

用 live/dead 染料標(biāo)記死活，anti-CD3、anti-CD4、anti-CD8 對細(xì)胞膜蛋白進(jìn)行染色后，Cytofix/CytopermTM 對細(xì)胞進(jìn)行固定和破膜，用 anti-IFNγ 和 anti-TNFα 染色，通過流式細(xì)胞術(shù)分析評估 T 細(xì)胞對 CEF 肽庫的特異性，測定約 25% 的 CD8+ T 細(xì)胞在 CEF 刺激下產(chǎn)生了 IFNγ。

對分泌 IFNγ 的 CEF 特異性 CD8+ T 細(xì)胞通過 IFNγ 磁性介導(dǎo)的 T 細(xì)胞分選進(jìn)行富集，并在含有輻照飼養(yǎng)層細(xì)胞、150UI/mL IL2 和 1pg/mL PHA 的條件下培養(yǎng) 14 天。細(xì)胞內(nèi) IFNγ 染色后，通過流式細(xì)胞術(shù)分析 CD8+ T 細(xì)胞特征進(jìn)一步增強(qiáng)了（ Fig. 2）。

Fig.2 流式分析工作流程中 CD8+ T 細(xì)胞的特征

使用 DispenCell 對富集的 CEF 特異性 CD8+ T 細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞克隆。研究人員共分離了三塊 96 孔板用于測試 DispenCell 分配細(xì)胞克隆效率和可重復(fù)性，并使用 DispenSoft 對單細(xì)胞分離進(jìn)行基于阻抗的質(zhì)量控制。同時采用有限稀釋方法作為對照，分離后在含有輻照飼養(yǎng)層細(xì)胞，150UI/mL IL2 和 1pg/mL PHA 的條件下 T 細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增 14 天。

根據(jù)基于顆粒大小的直方圖（Fig.3A），將篩選閾值設(shè)置為 100 歐姆，以區(qū)分單個 T 細(xì)胞與碎片。軟件將含有不同數(shù)目顆粒的孔用顏色加以區(qū)分以便質(zhì)量控制（Fig.3B）。在該圖中，只有包含單個細(xì)胞的孔以綠色標(biāo)記，而其他孔則以紅色標(biāo)記，阻抗顯示單細(xì)胞（Fig.3C）和雙細(xì)胞（Fig.3D）的峰值特征。使用相同的軟件，我們可以訪問每個孔的阻抗曲線，以進(jìn)行額外的質(zhì)量控制。

Fig.3 DispenCell 分離單細(xì)胞的質(zhì)量控制

單細(xì)胞分離平均效率（綠色孔的百分比）為 83%，每塊板的平均分配時間為 8 分鐘。結(jié)果證明了 DispenCell 基于阻抗的單細(xì)胞分配技術(shù)的高效性和實用性，另外根據(jù)阻抗分布，軟件可提供即時的單克隆性理論證明。

作者為了進(jìn)一步證明 DispenCell 分離后細(xì)胞的單克隆性，對 DispenCell 或有限稀釋克隆方法分離的 CD8+ T 細(xì)胞克隆進(jìn)行了 TCRβ 鏈測序。通過檢測同一樣品中 TCRβ 位點的單克隆重排來證明樣品的單克隆性。測序分析表明，兩種克隆方法的樣品中 TCRβ 鏈主要為單克隆重排（Fig.4A），在使用 DispenCell 生成的 27 個生長克隆中，其中 25 個呈現(xiàn)對應(yīng)于 T 細(xì)胞單克隆的單一優(yōu)勢 TCR β 鏈序列（Fig.4B）。而通過有限稀釋，僅 18 個 T 細(xì)胞克隆表現(xiàn)單一優(yōu)勢 TCRβ 鏈序列。DispenCell 提供了比有限稀釋更高的單克隆效率和可靠性。

作者研究了 DispenCell 克隆方法對 CD8+ T 細(xì)胞功能的影響。使用 CEF 肽庫進(jìn)行體外刺激后，細(xì)胞內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)分析表明，通過 DispenCell 分離并擴(kuò)增的 CD8+ T 克隆能夠產(chǎn)生大量的 IFNγ 和 TNFα（Fig.4C）。這些結(jié)果表明，DispenCell 克隆方法不會改變特定 CD8+ T 細(xì)胞克隆的功能。

Fig.4 CD8+ T 細(xì)胞單克隆性和功能特征的驗證