流式細胞術中的配色是非常重要的，因為它直接影響到對細胞亞群的準確鑒定和定量分析。使用流式細胞術進行免疫分型，不同的細胞亞群在表型和功能上可能存在差異。通過合理的配色設計，可以選擇具有特定表面標記物的抗體，從而區分和鑒定不同的細胞亞群。準確的配色可以幫助我們了解細胞群體的復雜性，并識別和研究不同亞群的特征和功能。

如果配色不合理又會怎樣呢？

請看下面兩組配色，使用的免疫標志物都是一樣的，只是在熒光素的搭配上不一樣。

接下來我們看兩組配色的結果

可以看出從配色的結果，CD25的表達兩個配色結果接近，但是第1組配色中，CD69陽性的細胞很難檢出。不合理的配色會導致出現假陰性信號，這里我們就從這個例子出發，看如何一步一步的發現配色中的問題所在，并且糾正。

在尋找配色錯誤搭配之前，要知道是什么導致了不同配色產生了這種差異。

造成這種原因其實就是我們平時說到spreading現象。

Nguyen, Richard, et al. "Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design." Cytometry Part A 83.3 (2013): 306-315.

由于spreading現象，所以在共表達檢測中會產生一個信號交疊的區域，我們稱為“灰區”。

雖然FMO（Fluorescence-Minus-One）控制方法可以防止潛在的背景事件被錯誤地分類為陽性，但它忽視了由背景群體的上限和低表達陽性群體的下限所構成的“灰區”。這個“灰區”包含了無法區分的陰性和低表達陽性事件。

那么我們如何發現并且避免呢？我們可以使用“switch-off” (SWOFF)模型進行判斷。

我們可以充分利用FMO樣本，對通道進行檢查，為了便于觀察，我們可以將FMO樣本與完全染色疊加，去驗證spreading的干擾程度。并且判斷是否需要優化。

我們結合具體實驗進行講解。

兩組不同的配色，我們使用SWOFF模型來尋找問題出在哪里。通過對比關鍵散點圖中全染與FMO的散點圖疊加。

允許在配色驗證過程中早期排除效果不佳的組合。盡管CD45-ECD（panel 3）標記了所有的白細胞，并且在左圖中通過溢出擴散實際上掩蓋了CD4+CD127hiCD117+亞群，但T細胞缺失的CD19-ECD（panel 4）并不影響CD4+CD127+CD117+的檢測，右圖所示。

在右圖中，SWOFF分析揭示了盡管CD8-APC-A700+在Panel 4中對APC探測器產生了較強的擴散影響，但對雙峰式的CD4-APC的檢測沒有影響。左圖顯示了panel 3在APC通道中較低的溢出擴散，但實際上這并沒有優于panel 4。

揭示了成熟T細胞上CD4與CD8的排他性表達特征，使得門控策略能夠規避與溢出擴散相關的群體分離的影響。

SWOFF分析是一種經濟且信息豐富的工具，可以驗證抗體偶聯物的選擇，并揭示數據解釋的潛力。

一方面，FMO可以作為很好的對照，區分陰性與陽性信號，另一方面，由于某些抗體配色破壞了對其共表達的低表達抗原目標群體的門控策略。FMO也可以輕松識別出方案是否對于低表達抗原檢測的靈敏度低。即使基于純粹的散射門控也可以進行SWOFF分析。

即便使用熒光通道與散射光信號，使用SWOFF模型也能很好地評估Spreading的影響。

需要注意的是，對于具有雙峰表達特征的群體門控標記物（例如CD3等），不需要使用FMO進行劃門，因此往往會被省略。相反，在SWOFF模式下分析結果時，排除強標記物的意義非常重要，因為它們對其他探測器上的溢出擴散的貢獻可能很大，這表明FMO控制方法應包括所有標記物。

如果大家想降低spreading，就需要借助科技的力量啦。CytoFLEX系列流式細胞儀采用APD檢測器，相較于以前的PMT檢測器擁有更高的靈敏度，并且更小的spreading現象。這使得配色也更加的輕松，結果也更加的準確。

在流式分析時讓您能夠輕松獲得更加精 準的結果，在流式分選時也不遺漏您珍貴的弱陽性細胞。