基因定點(diǎn)突變是目前生物學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中的重要實(shí)驗(yàn)技術(shù)，是改造、優(yōu)化基因的便捷方案。對已知DNA片段的特定堿基進(jìn)行定點(diǎn)改變、缺失或者插入，可以改變對應(yīng)的氨基酸序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，可用于研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的復(fù)雜關(guān)系。

目前基因突變主要使用PCR介導(dǎo)的突變引入技術(shù)，常見的基因定點(diǎn)突變方法有重疊延伸PCR 法和滾輪擴(kuò)增法，各方法有利有弊。

圖1. 基于重疊延伸PCR的定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)流程

常規(guī)重疊延伸PCR需設(shè)計(jì)一對涵蓋突變位點(diǎn)的引物進(jìn)行兩輪PCR，第一輪PCR由正向外側(cè)引物與突變引物合成片段1，由另一突變引物與反向外側(cè)引物合成片段2；第二輪PCR利用兩個(gè)片段作為模板擴(kuò)增出含突變位點(diǎn)的全長基因。該方法最大的缺陷是操作相對繁瑣，兩輪PCR擴(kuò)增和頻繁的DNA回收操作會(huì)提高原始質(zhì)粒污染的風(fēng)險(xiǎn)，并且第二輪PCR受影響因素較多，有時(shí)反復(fù)調(diào)整PCR反應(yīng)條件也不能獲得目標(biāo)基因。

圖2. 基于滾輪擴(kuò)增原理的定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)流程

基于滾輪擴(kuò)增原理的定點(diǎn)突變方法需設(shè)計(jì)一對包含突變位點(diǎn)的引物（正、反向），和模版質(zhì)粒退火后用DNA聚合酶擴(kuò)增，獲取的擴(kuò)增片段完成5‘端磷酸化后在DNA連接酶的作用下環(huán)化，原始質(zhì)粒在DpnI的酶切作用下被消化，最終獲得突變質(zhì)粒，該方法的缺陷在于7-10 Kb全長質(zhì)粒的擴(kuò)增往往不順利，若不徹底消化原始質(zhì)粒也容易產(chǎn)生假陽性克隆。同時(shí)，若需要完成多位點(diǎn)的定向突變，則需要花費(fèi)更多的時(shí)間精力以及試劑成本。

圖3. 基于同源重組技術(shù)的定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)流程

目前市面上還存在著一種基于同源重組技術(shù)的定點(diǎn)突變方法，該方法需要在反向PCR引物中引入同源臂和突變位點(diǎn)，獲取的產(chǎn)物在剔除掉原始模板后，于重組酶的作用下發(fā)生同源重組形成全長目的基因。該方法應(yīng)用范圍廣，可進(jìn)行單點(diǎn)、多點(diǎn)突變以及插入缺失等等，擴(kuò)增的片段長度更長，可滿足十幾Kb全長基因的擴(kuò)增需求，所要花費(fèi)的時(shí)間精力等成本更少。
 

三種定點(diǎn)突變方法比對

翌圣生物匠心研發(fā)的定點(diǎn)突變試劑盒基于Hieff Clone® 快速克隆技術(shù)的定點(diǎn)突變系統(tǒng)，目標(biāo)質(zhì)粒擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DpnI消化、Hieff Clone®重組環(huán)化后直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化即可完成定點(diǎn)突變。高效快速的實(shí)現(xiàn)直接對目標(biāo)質(zhì)粒中的靶位點(diǎn)進(jìn)行單點(diǎn)突變，多點(diǎn)突變，以及插入或缺失等。