基因治 療利用遺傳物質(zhì)治 療或預(yù)防疾病——通常是可能危及生命或致人衰弱且治 療選擇有限的罕見遺傳性疾病。目的是開發(fā)出一種一次性療法，以糾正疾病的潛在遺傳原因。

最 早的方法是直接將遺傳物質(zhì)（如功能性基因）導(dǎo)入細胞，以替換、沉默或操縱特定基因，但存在轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低，脫靶效應(yīng)等問題。因此，科學(xué)家們也在開發(fā)直接基因編輯技術(shù)，包括引入分子工具，在細胞中的精確位置移除或糾正現(xiàn)有的 DNA 片段。

基因治 療的成功依賴于使用合適的載體將遺傳物質(zhì)安全有效地遞送到受影響的細胞中。該載體或可被直接遞送至人體由單個細胞吸收，或可在實驗室中遞送至患者細胞樣本然后返回人體。某些病毒由于具有感染細胞的能力，常被用作基因治 療的載體。一些類型的病毒，如逆轉(zhuǎn)錄病毒，將包括新基因在內(nèi)的遺傳物質(zhì)整合到細胞染色體中。其他病毒，如腺病毒，則將其 DNA 轉(zhuǎn)移到細胞核中，但不與細胞染色體進行整合。此外，病毒還可將基因編輯工具遞送至細胞核內(nèi)。

迄今為止，已有 23 種基因和細胞治 療產(chǎn)品獲得美國 FDA 批準，其中包括對神經(jīng)肌肉疾病、遺傳性失明、某些血液癌癥等疾病的顛覆性療法。

2022 年 6 月 22 日，醫(yī)麥課堂攜手安捷倫在線上舉辦，由安捷倫細胞分析事業(yè)部 PLXF 產(chǎn)品專員王捷思、PLXF 產(chǎn)品應(yīng)用科學(xué)家魏玉鳳和診斷與基因組學(xué)事業(yè)部產(chǎn)品經(jīng)理張佳為我們帶來了主題為“基因治 療技術(shù)進展”的線上直播課程，助力中國醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)人才成長。

線粒體功能評估方法

安捷倫產(chǎn)品專員王捷思的分享內(nèi)容主要包括：

?線粒體疾病介紹

?Seahorse 技術(shù)在基因治 療研究中的應(yīng)用

線粒體，是細胞內(nèi)的能量工廠，是產(chǎn)生 ATP 的主要場所，除了與罕見遺傳病相關(guān)外，線粒體的功能障礙也與許多常見的疾病相關(guān)。在細胞內(nèi)產(chǎn)生能量的另外一條途徑是糖酵解。線粒體呼吸和糖酵解作為細胞內(nèi)產(chǎn)生能量的兩條主要的途徑，在細胞的各種過程中發(fā)揮著重要的作用。無論是細胞的增殖、分化還是免疫細胞的反應(yīng)或者是細胞的凋亡都與能量代謝密切相關(guān)。

對于線粒體呼吸這條途徑，細胞利用不同的底物，比如葡萄糖、脂肪酸、氨基酸，線粒體消耗氧氣氧化底物來產(chǎn)生 ATP。所以可以通過測量細胞外溶液中的氧氣濃度的變化得到細胞氧消耗速率（簡稱為 OCR）來測量線粒體呼吸水平。對于糖酵解途徑，細胞利用葡萄糖最終轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗?，會分泌氫離子到細胞外溶液中引起細胞外溶液的酸化，可以通過測量細胞外溶液中的氫離子濃度變化得到細胞外的酸化速率（簡稱為 ECAR）再換算為質(zhì)子流出速率（簡稱為 PER）來反映糖酵解水平。

通過線粒體壓力測試，可以得到如下的一個曲線圖

線粒體壓力測試

縱坐標是 OCR 也就是細胞的氧消耗速率，橫坐標是時間。在測量起始 OCR 值后，可以通過加入寡霉素抑 制線粒體 ATP 合酶，此時 OCR 值會降低，這樣就得到了 ATP 產(chǎn)生相關(guān)聯(lián)的 OCR 值；之后加入 FCCP，加速線粒體電子傳遞以刺激細胞達到最大的氧消耗，此時 OCR 值會升高，得到細胞的最大呼吸能力，最大值和基礎(chǔ)值之間的差值，稱為備用呼吸能力，用來衡量細胞在面對有更多的能量需求，或者是在面對壓力的時候的反應(yīng)能力。

最后加入魚藤酮和抗霉素 A，來分別抑 制復(fù)合物 I 和復(fù)合物 III，此時 OCR 值會降低，剩下的 OCR 值是非線粒體的氧消耗。通過此實驗可以更加全面地來反映細胞的線粒體功能?？梢杂脕碓u估不同細胞的線粒體功能以驗證藥物或療法對細胞線粒體功能的影響。

活細胞成像分析技術(shù)

安捷倫產(chǎn)品應(yīng)用科學(xué)家魏玉鳳的講座主要介紹了：

?基因治 療產(chǎn)品的分類及上市藥物概覽

?微孔板檢測及成像設(shè)備在基因治 療領(lǐng)域的應(yīng)用

基因治 療主要是分成兩大類，第 一大類，是基于 DNA 的治 療；第二大類，是基于 RNA 的治 療?；?DNA 的治 療，又分成兩種，第 一種是離體基因治 療，一種是在體基因治 療。

對在體基因治 療來說，從 2003 年開始，溶瘤病毒、AAV、質(zhì)粒分別作為載體都有相關(guān)產(chǎn)品上市，針對適應(yīng)癥包括頭頸部鱗狀細胞瘤、黑色素瘤、肝癌、胰 腺癌、重度肢體缺血和因為基因突變導(dǎo)致的視力喪失等，其中以病毒為載體的產(chǎn)品占絕大多數(shù)。

Cytation 作為一款高通量的微孔板檢測及成像設(shè)備，可以幫助評價載體病毒體內(nèi)體外的轉(zhuǎn)染效率，溶瘤病毒的復(fù)制動力學(xué)，病毒釋放量，病毒滴度等，且其可配合自動化設(shè)備，實現(xiàn)無人值守的檢測及分析，減少實驗人員的工作量及暴露風(fēng)險。

Cytation 可開展的病毒學(xué)檢測類型

除此之外，Cytation 在前期構(gòu)建檢測模型、基因功能體外評價，抗腫瘤活性，血清水平表達產(chǎn)物檢測、免疫原性檢測等方面也有成熟的應(yīng)用;在質(zhì)控方面，Cytation 可以幫助開展殘留蛋白檢測、內(nèi)毒素檢測、病毒滴度評價等實驗。

微孔板檢測及成像設(shè)備在 AAV 領(lǐng)域的應(yīng)用

微孔板檢測及成像設(shè)備在溶瘤病毒領(lǐng)域的應(yīng)用

核酸蛋白質(zhì)控方案

安捷倫產(chǎn)品經(jīng)理張佳演講的部分內(nèi)容：

?基因編輯中 gRNA 的質(zhì)控

?同源修復(fù)時的 Long ssDNA 模板質(zhì)控

在 CRISPR 工作流程中，向?qū)?RNA(gRNA）的合成是成功進行基因編輯的關(guān)鍵組成部分。由體外轉(zhuǎn)錄或合成產(chǎn)生的 gRNA 可以在毛細管電泳上運行檢測。小 RNA 試劑盒是此應(yīng)用的理想選擇，它可以從 6-150 個核苷酸的小分子中以高分離度分離。研究人員需要關(guān)注雜質(zhì)或次級結(jié)構(gòu)等重要特征，使樣品具有預(yù)期的大小和足夠的產(chǎn)量，以便用于后續(xù)研究。

Long ssDNA 作為 Donor 模板已被發(fā)現(xiàn)可以促進同源修復(fù)，提高片段敲入效率。片段分析儀系統(tǒng)可用于 dsDNA 酶解產(chǎn)生的 ssDNA 產(chǎn)物的質(zhì)量控制分析。當 dsDNA 分子量正確并且 ssDNA 分子量較小時，則可得知 dsDNA 已成功酶解。

在高表達單克隆篩選時，可選擇用芯片式毛細管電泳的方法比較單克隆株蛋白表達量，篩選高表達細胞株。與常規(guī)毛細管電泳相比，芯片式毛細管電泳具備分離時間短、分離效率高、系統(tǒng)體積小且易實現(xiàn)不同操作單元的集成等優(yōu)勢。此時安捷倫的 BioAnalyzer 2100 生物分析儀因為具備金標準、高靈敏度、快速、節(jié)省樣本等特點可優(yōu)先考慮使用。

除此之外，2100 分析儀還能針對蛋白做定性或定量分析，因此不僅是在克隆篩選方面，還可以在表達條件優(yōu)化、純化條件優(yōu)化、純化產(chǎn)物分析、蛋白制劑穩(wěn)定性分析、蛋白雜質(zhì)檢測等方面有較好的應(yīng)用。

Q&A 環(huán)節(jié)節(jié)選

Q：seahorse 測 ATP 生成速率與測 ATP 水平有什么區(qū)別?

A：Seahorse 能夠?qū)崟r同時測量活細胞中線粒體呼吸和糖酵解 ATP 生成速率，評估細胞代謝表型和代謝轉(zhuǎn)換。

Q：Cytation 開展病毒學(xué)檢測的優(yōu)勢有哪些?

A:首先，病毒學(xué)的檢測模式有很多，酶標的檢測模式和成像的檢測模式可以相互互補；其次，它本身是一個自動化設(shè)備，而且可以配置高通量的自動化設(shè)備，可實現(xiàn)無人值守的操作以減少實驗人員的勞動；最后是軟件具有自動化的數(shù)據(jù)分析功能，可避免付出額外的時間。

Q：毛細管電泳的靈敏度是多少？

A：靈敏度DNA：5pg/ul，RNA：50 pg/ul，Protein：1 pg/ul