干貨分享 | 常用的細胞凋亡檢測方法匯總

2022-12-16 00:00:00 21閱讀次數

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細胞凋亡（Apoptosis）是細胞程序性死亡（Programmed cell death）的一種，由基因嚴格控制，對于控制細胞生長，發育和更新至關重要。細胞凋亡的激活主要是由兩種途徑，一種是內源性的由細胞內應激反應或是內部凋亡信號引起線粒體釋放細胞色素C（Cytochrome C），激活Caspase家族誘發細胞凋亡；另一種是外源性的由細胞表面的受體接收凋亡信號后激活Caspase家族從而誘發細胞凋亡。可包括一系列特征性變化，如細胞皺縮、核固縮、核碎裂、凋亡小體形成等形態學變化以及DNA特征性片段化、新基因表達、某些生物大分子合成等生物化學變化。

細胞凋亡檢測是測定細胞凋亡的過程，通常使用一些特定的實驗技術和方法來檢測，如：Annexin V-PI雙染法、TUNEL方法這些檢測技術和方法可以有效地檢測細胞凋亡，對于了解細胞凋亡的發生機制，及時防治疾病具有重要的意義。

圖1.細胞凋亡過程（From Wikipedia）

細胞凋亡的檢測方法正是基于凋亡細胞特殊的形態學改變和生物化學變化而設計的。

原位末端標記法TUNEL

細胞凋亡形成的DNA斷裂會暴露DNA鏈的3’-OH末端，末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT）可催化斷裂DNA的3′-OH端的核酸聚合反應，加入帶有熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素標記的dUTP，顯色反應后可特異地進行原位凋亡細胞的檢測。正常或增殖細胞幾乎沒有 DNA的斷裂，故很少被染色。

圖2.YEASEN TUNEL-FITC試劑盒檢測凋亡細胞樣本

Annexin V/PI雙染法

正常細胞中，細胞膜上的磷酯酰絲氨酸（phosphotidylserine，PS）位于細胞質一側，細胞凋亡早期，磷脂酰絲氨酸從細胞膜胞質側翻轉到細胞膜外表面。Annexin V是一種Ca²⁺依賴的磷脂結合蛋白，可與外翻的PS特異性結合，用Annexin V（熒光素或生物素標記）作為熒光探針，并與PI同時使用，借助FCM分析染色情況，其中Annexin V-／PI-、Annexin V+／PI+、Annexin V+／PI-、Annexin V-／PI+分別表示正常、晚期凋亡或壞死、早期凋亡和機械性損傷的細胞。

圖3.YEASEN Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡

線粒體膜電位變化的檢測

處于凋亡早期的細胞，在顯微鏡下還未出現顯著變化時，細胞內線粒體膜電位已經開始改變：線粒體膜通透性增加，跨膜電位下降。膜電位下降被認為是凋亡最早的生物學變化，如果膜電位被破壞，細胞凋亡將不可逆轉。一些親脂陽離子熒光染料，如羅丹明123、JC-1等可與線粒體基質緊密結合，線粒體膜電位下降程度和線粒體聚集染料能力下降程度呈現正相關。

圖4.YEASEN JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒檢測膜電位變化[3]

細胞凋亡的Ca2+濃度變化測定

細胞的生命活動都離不開 Ca2+，Ca2+超載時，線粒體通透性轉換孔開放，細胞內外Ca2+平衡被破壞，導致細胞凋亡。用 Ca2+特異性熒光探針，如Rhod-2、Indo-1、Fluo-4等對細胞進行標記后，再用 FCM 或熒光、共聚焦激光顯微鏡檢測，可以準確地得出細胞凋亡的生理指標。

圖5.YEASEN Fluo-4， AM，細胞膜可滲透鈣離子熒光探針[4]

胱天蛋白酶（caspase）活性檢測

caspase-3 被認為是各種因素導致凋亡的關鍵酶，生理狀態下它以酶原的形式存在，它的活化預示著細胞執行凋亡程序的開始，是凋亡進入不可逆階段的標志。目前，壞死細胞中尚未發現有caspase-3 的活化，因此，通過檢測 caspase-3 活力強弱可判斷細胞是否凋亡或壞死。一般有檢測含量和檢測活性兩種。檢測含量是用Western blot、免疫組化或免疫熒光的方法進行Caspase定量或相對定量。檢測活性則是利用熒光素偶聯的可被Caspase特異性識別的短肽，在Caspase切割短肽后，熒光素會被釋放出來，可以根據熒光強度判斷Caspase活性。

細胞凋亡相關基因及其產物的檢測

細胞凋亡時某些基因表達異常產物，這些基因轉錄翻譯出來的產物可促進或抑制細胞凋亡，如細胞凋亡蛋白家族、凋亡蛋白酶活化因子1（Apaf-1）及 Fas等。這些相關基因及其表達產物的測定可為細胞凋亡檢測提供依據。

YEASEN細胞凋亡檢測系列產品

產品名稱	貨號	規格
Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒	40302ES20/50/60	20T/50T/100T
Annexin V-EGFP/PI 細胞凋亡檢測試劑盒	40303ES20/50/6	20T/50T/100T
Annexin V-Alexa Fluor 647/PI 細胞凋亡檢測試劑盒	40304ES20/50/6	20T/50T/100T
Annexin V- Alexa Fluor 488/PI 細胞凋亡檢測試劑盒	40305ES20/50/6	20T/50T/100T
TUNEL Apoptosis Detection Kit(FITC) TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(FITC)	40306ES20/50/6	20T/50T/100T
TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(Alexa Fluor 488)	40307ES20/50/6	20T/50T/100T
TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(Alexa Fluor 640)	40308ES20/50/6	20T/50T/100T
Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Detection Kit Annexin V-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒	40310ES20/50/6	20T/50T/100T
JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒	40706ES60	100T
JC-10 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit JC-10 線粒體膜電位熒光探針	40752ES60	100T

參考文獻

[1]李媛媛, 吳洪娟. 雙氫青蒿素體外誘導人乳腺癌細胞凋亡的電鏡研究[J]. 電子顯微學報, 2015(02):138-141.

[2] Suman S,Pandey A, Chandna S. An improved non-enzymatic “DNA ladder assay” for more sensitive and early detection of apoptosis[J]. Cytotechnology, 2012, 64(1):9-14.

[3] Liang W L, Xiao L, Gu H W , et al. Solid lipid nanoparticle induced apoptosis of macrophages via a mitochondrial-dependent pathway in vitro and in vivo[J]. International Journal of Nanomedicine,2019,14:3283-3295.

[4] Fu R, Xia Y, Li M,et al.Pim-1 as a therapeutic target in human lupus nephritis[J]. Arthritis and Rheumatology, 2019, 71(8).

[5]何玉婷,楊雯,王改琴,等. 細胞凋亡主要檢測方法及其應用[J].醫學綜述,2019,25(04):156-160+165.

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