研究：腦膠質瘤治療取得進一步進展

2023-09-01 11:28:32 106閱讀次數

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前言：小兒和成人高級別膠質瘤是Z常見的原發性惡性腦腫瘤，中位生存期僅為幾年。常規療法，包括手術、放療和藥物治療(通常是替莫唑胺化療)，并沒有明顯改善高級別膠質瘤患者生存結果^[1]。原因包括腫瘤在大腦周圍的侵襲性生長，妨礙了根治性手術切除和限制了局部治療的效用。膠質母細胞瘤 ( GBM ) 癌癥干細胞被認為參與了這一過程，但高級別膠質瘤浸潤的發生機制仍然知之甚少^[2,3]。靜止/慢循環干細胞在腦癌中的存在主要得到 scRNAseq、異種移植物生長實驗的數學建模和小鼠模型的支持，但它們的特異性/直接可視化和靶向性仍然具有挑戰性^{[4 – 7]}，這阻礙了對它們的機制研究。

來自意大利特倫托大學腦癌實驗室的 Francesco Antonica 團隊在《nature communications》雜志上近日發表題為 “A slow-cycling/quiescent cells subpopulation is involved in glioma invasiveness” 的文章，其團隊在兒童高級別膠質瘤患者中發現了非增殖狀態下表達 Prominin-1 的惡性細胞群。利用基因工具觀察和切除小鼠腦癌及人類癌癥類器官中的靜止細胞，揭示了它們在腫瘤核心和邊緣的定位，并證明了靜止細胞參與腦癌細胞的浸潤。Z 后，他們發現 DYRK1A/B 抑制劑 Harmine 可以部分減少靜止和浸潤癌細胞的數量。通過高內涵成像分析系統，在人類腦癌類器官和 GBM 細胞系中測試 Harmine 靶向靜止細胞可減少腫瘤侵襲。數據表明，靜止細胞亞群部分參與了腫瘤侵襲，這是腦癌發病的主要原因之一。

首先，該團隊在人類膠質瘤(成人和兒童)中鑒定出一類惡性非循環 PROM1⁺ 的細胞，Prominin-1 簡稱 PROM1，也叫 CD133，在許多種類的癌癥中都是癌癥干細胞的標志物，其中就包括人類腦癌。Prominin-1 陽性 ( PROM1⁺ ) 的細胞參與了腫瘤浸潤，且能夠抵抗放療和化療，導致癌癥復發。通過對 5742 個成人膠質瘤細胞和 2188 個兒童膠質瘤細胞進行 RNA 測序，分析它們的表達譜，其中有 6863 個細胞是惡性的，在這些惡性細胞中識別出 11% 的成人細胞和 16% 的兒童細胞是非循環 PROM1⁺ 細胞。除此之外，該團隊還分析了其他的膠質瘤干細胞標記物，發現 54% 的細胞表達 SOX2 和 OLIG2，32% 只表達 SOX2，6% 只表達 OLIG2。另外一個重要發現是，這些非循環 PROM1⁺ 細胞高表達的基因與細胞粘附和擴散有關。

之后，該團隊在小鼠膠質瘤模型中建立了體內靜止細胞的可視化方法。他們構建了 Prom1-Venus-p27 和 Sox2-Venus-p27 兩種報告基因，在小鼠腦中測試了其效果，98.2% 的 Prom1-Venus-p27⁺( qProm1 ) 細胞和 98.7% 的 Sox2-Venus-p27⁺( qSox2 ) 細胞中沒有 Ki67 這種增殖標志物的表達，證明建立的方法可行。接著，該團隊將這種方法應用于小鼠腦癌模型中，獲得的結果與前面類似，他們發現此模型中存在 Prom1⁺/SOX2⁺ 和 Prom1⁺/SOX2^- 兩類靜止細胞，且 qProm1 細胞在腫瘤核心部位和浸潤邊緣都有出現，這與以往的研究結果完全一致。接下來，該團隊利用白喉毒素片段 A ( DTA ) 融合 p27K 的方法消除腫瘤發生過程中的 qProm1 細胞。發現消除了 qProm1 細胞后，腫瘤模型小鼠的存活天數增加了(對照：56 天 vs 實驗組：78 天)，且腫瘤體積也相應的縮小了。在已經形成的腫瘤中，消除 qProm1 細胞可以減少浸潤細胞的數量，因此， qProm1 細胞導致了腫瘤細胞的浸潤和擴散。

該團隊還在人類兒童腦類器官中對浸潤靜止細胞進行了可視化，具體的做法是在人類誘導多能干細胞 ( hiPSCs ) 分化的背側前腦類器官中通過電穿孔的方式將 TP-Cherry 轉入其中以構建出人類腦癌類器官模型 ( 圖1, a )，采用 Molecular Devices 公司的 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦高內涵成像分析系統對電穿孔 30 天 ( 30dpe ) 后的類器官進行活細胞成像，和對照相比可以看出有明顯的 mCherry⁺ 熒光的擴散 ( 圖1, b )。后續實驗表明，通過 DTA-p27 消除類器官中的靜止細胞后，腫瘤細胞的浸潤減少了。由此，該團隊成功建立了基于兒童腦癌類器官模型，用于研究靜止浸潤細胞的作用。

圖1 | Direct visualization and targeting of infiltrating quiescent cells in human brain cancer organoids.

Z 后，為了尋找能夠作用于靜止細胞，減少靜止細胞數量的藥物，該團隊利用前面介紹過的類器官模型對兩種 DYRK1A/B 抑制劑 ( AZ191 和肉葉蕓香堿) 以及其他能夠消除靜止細胞的藥物進行測試 ( 圖2, a ) ，在 Molecular Devices 公司的 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦高內涵成像分析系統上進行高通量圖像采集和分析，發現肉葉蕓香堿和辛伐他汀能夠降低 mVenus 的信號 ( 圖2, c )。緊接著，又測試了 GB7 癌癥干細胞和 COMI 細胞系 ( 圖2, e )，對靜止細胞的數量做了統計，發現肉葉蕓香堿同樣可以減少兩種細胞中的靜止細胞 ( 圖2, f )。除此之外，經過肉葉蕓香堿處理后的 GBM 癌癥干細胞的侵襲能力也受到了抑制 ( 圖2, g )，而在 GB7 細胞球中，肉葉蕓香堿也降低了細胞的侵襲程度。以上實驗表明肉葉蕓香堿可能會成為一種治療高級別膠質瘤的治療方案。

圖2 | Pharmacological targeting of quiescent cells tested in human brain cancer organoids and GBM cell line reduces invasion.

綜上所述，盡管人類腦癌中的靜止干細胞已被證實存在，但它們在癌癥中的浸潤作用依然不清楚。而本文的研究團隊識別出在人類腦癌樣本中存在一類表達 Prominin-1 的惡性非循環細胞，闡述其與腫瘤細胞的粘附和擴散有關，并在小鼠膠質瘤模型中建立了體內靜止細胞的可視化方法，同時也證明消除這種靜止細胞的腫瘤，細胞侵襲能力顯著減弱。Z 后，該團隊更是利用目前流行的細胞實驗技術由 hiPSCs 誘導分化形成的腦類器官結合共聚焦高內涵成像分析系統展示了消除腦癌類器官中的靜止干細胞對腫瘤形成的改善作用，以及通過高內涵擅長的高通量篩選及圖像分析發現了能夠靶向并抑制靜止干細胞的藥物肉葉蕓香堿，為臨床治療膠質瘤提供了新的方案。

參考文獻

1. Sturm, D. et al. Paediatric and adult glioblastoma: multiform (epi)genomic culprits emerge. Nat. Rev. Cancer 14, 92–107 (2014).

2. Prager, B. C., Bhargava, S., Mahadev, V., Hubert, C. G. & Rich, J. N.Glioblastoma stem cells: driving resilience through chaos. Trends Cancer 6, 223–235 (2020).

3. Rusu, P. et al. GPD1 Specifically marks dormant glioma stem cellswith a distinct metabolic profile. Cell Stem Cell 25,241–257.e8 (2019).

4. Chen, J. et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature 488, 522–526 (2012).

5. Patel, A. P. et al. Single-cell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity in primary glioblastoma. Science 344, 1396–1401 (2014).

6. Liau, B. B. et al. Adaptive chromatin remodeling drives glioblastomastem cell plasticity and drug tolerance. Cell Stem Cell 20,233–246.e7 (2017).

7. Lan, X. et al. Fate mapping of human glioblastoma reveals an invariant stem cell hierarchy. Nature 549, 227–232 (2017).

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