免疫熒光實驗原理

　　免疫熒光(IF)是使用顯微鏡深入了解細胞結構和過程的有效方法。此方法可評估特定蛋白質的表達和位置，使得免疫熒光成為科學家解決許多細胞生物學問題不可或缺的工具。

　　免疫熒光實驗基于以下主要步驟：

　　1.特異性抗體與感興趣的蛋白質結合。

　　2.熒光染料與這些免疫復合物偶聯，以便使用顯微鏡觀察感興趣的蛋白質。

　　內皮細胞中vWF的免疫熒光染色。肌動蛋白用phalloidin染色(綠色)，細胞核用DAPI染色(藍色)。

　　區分直接和間接免疫熒光。在直接免疫熒光中，一抗直接偶聯到熒光團（也稱為熒光色素），便于處理和快速可視化。在間接免疫熒光中，使用特異性結合一抗的二級熒光團偶聯抗體來可視化感興趣的結。

　　盡管di二種方法比直接免疫熒光更耗時，但它有幾個顯著的優勢，比如它通常更便宜，因為二抗可以用于不同的一抗。此外，通過結合多個一抗和特定的二抗(每個抗體都用不同的熒光團標記)，可以在單個樣品中平行特異地顯示多個蛋白質(多色免疫熒光)。

　　免疫熒光染色:典型的工作流程

　　每個免疫熒光染色方案由培養、固定、染色、成像四個主要步驟組成，可細分如下:

　　免疫熒光染色是一種非常敏感的方法，可能需要排除故障《免疫英冠染色故障排除指南》。方案中的微小變化可能會導致不同的結果，而這些結果不再具有可比性。因此，在您的特定方案中精確地保持完全相同的條件是非常重要的(例如，細胞密度、抗體稀釋度、培養溫度和培養時間)。

　　免疫熒光實驗方案對比

　　傳統染色與ibidi方案染色

　　當使用任何ibidi解決方案時，ibidi的免疫熒光染色方案比傳統方案要簡便快速的多。無需在松散的蓋玻片上生長細胞，細胞可直接在ibidi玻片上生長和染色。

　　用于免疫熒光應用的各種ibidi產品

　　更多ibidi相關產品的免疫熒光實驗應用可查閱我們雷萌公眾號相關文章！

　　參考文獻

　　K.G. Zyner, A. Simeone, S.M. Flynn, et al. G-quadruplex DNA structures in human stem cells and differentiation. Nat Commun, 2022, 10.1038/s41467-021-27719-1

　　C. Xu, et al. NPTX2 promotes colorectal cancer growth and liver metastasis by the activation of the canonical Wnt/beta-catenin pathway via FZD6. Cell Death & Disease, 2019, 10.1038/s41419-019-1467-7

　　Kobayashi, T., et al. Principles of early human development and germ cell program from conserved model systems. Nature, 2017, 10.1038/nature22812

　　H. Tada et al. Porphyromonas gingivalis Gingipain-Dependently Enhances IL-33 Production in Human Gingival Epithelial Cells. PloS one, 2016, 10.1371/journal.pone.0152794

　　Read article

　　01、故障排除

　　免疫熒光染色是一種非常敏感的方法，需要大量的經驗和不斷優化。方案中微小的變化可以顯著改變結果。如果遇到低信號、無信號或高背景，請參閱以下故障排除指南：

　　高背景：

　　02、ibidi解決方案

　　用于倒置顯微鏡的具有蓋玻片底部的ibidi μ-Slides腔室載玻片和μ-Dishes培養皿有多種幾何形狀可供選擇，可滿足您對免疫細胞化學的任何特定需求。所有免疫熒光染色步驟都可以直接在載玻片或培養皿中進行。

　　ibidi通道載玻片的幾何形狀非常適合精確交換少量的培養基，這在免疫細胞化學染色過程中是必要的。此外，通道μ-Slides的蓋玻片底部無需額外的蓋玻片。

　　在ibidi腔室載玻片中，帶有可移除的硅膠培養小室安裝在標準玻璃蓋玻片上，非常適合長時間樣品保存。

　　03、低信號或無信號

　　1. 基本信息

　　下面的應用描述了小鼠巨噬細胞系RAW-264.7（生物安全等級2）在ibidi μ-Slides VI 0.4 和8孔腔室載玻片的培養方案。這是一個特殊的細胞系的例子，用于顯示粘附時間，細胞密度和細胞形態的示范。本應用可根據您的具體實驗要求進行調整。

　　2. 材料

　　在設置中應用下列材料：

　　·RAW-264.7 (murine macrophages, CLS - Cell Lines Service, Biosafety Level 2) 

　　·Medium: RPMI 1640 with 2 mM L-Glutamin and 10% FBS 

　　·μ-Slide VI 0.4, ibiTreat （ibidi 80606）

　　·μ-Slide 8 well, ibiTreat （ibidi 80826）

　　·Accutase (PAA Laboratories GmbH) 

　　·1x Phosphate buffered saline (PBS) 

　　3. 細胞培養與材料制備

　　在將細胞接種到玻片中之前，按照常規的方法培養細胞。

　　μ-Slide VI 0.4 ：通道玻片和培養基，在37℃和5%CO2培養箱中培養過夜。這對于避免隨著時間的推移出現氣泡至關重要。為此，在50 ml器中填充適量的培養基，并輕輕地將瓶蓋擰緊。在 μ-Slide 8孔載玻片開放孔井中，氣泡可排出到大氣中。

　　拆開μ-Slide的包裝，把它放在μ-Slide支架上，并在準備細胞懸浮液時同時將蓋子放在 Luer 適配器/孔上。

　　4. 播種細胞

　　分離細胞：

　　吸出培養瓶中的培養基，并用PBS洗滌細胞一次。每75cm2 燒瓶中加入3-5 ml的Accutase，并將燒瓶放入培養箱中以加快分離速度。如果是RAW-264.7細胞系，則大約需要8分鐘。使用Accutase分離的細胞存活率更高。

　　4.1. 將細胞接種到μ-Slide VI 0.4中

　　在μ-Slide VI 0.4建議的細胞濃度：最終細胞數  0.3 x 10 5 cells/cm2，制備濃度6 x 10 5cells/ml。通過將移液器尖端直接放在通道的入口上，將30 μl細胞懸浮液填充到每個通道中。將蓋子蓋在玻片上，在37°C和5％CO2下孵育半小時以固定細胞。

　　細胞貼壁后，分別用60 μl無細胞培養基填充儲液池。 避免將移液器吸頭直接指向通道的入口。將玻片放回培養箱中。

　　圖1：接種后一小時，在ibiTreat μ-Slide VI 0.4（貨號80606）中的RAW-264.7

　　圖2: 在ibiTreat μ-Slide VI 0.4中的RAW-264.7，孵育24小時后

　　圖3:在ibiTreat μ-Slide VI0.4中的RAW-264.7，培養四天后

　　4.2 將細胞播種在μ-Slide 8 well 中

　　在μ-Slide 8 well建議的細胞濃度：最終細胞數 0.3 x 10 5 cells/cm2 ，制備濃度 1.1 x 10 5 cells/ml。將300 μl 的細胞懸浮液注入各孔中。將蓋子蓋在玻片上，在37°C和5% CO2中孵育。不需要進一步添加培養基。

　　圖4：在ibiTreat μ-Slide 8 well(貨號：80826)中的RAW-264.7，播種后1小時

　　圖5: 在ibiTreat μ-Slide 8 well中的RAW-264.7，孵育24小時后

　　圖6：在ibiTreat μ-Slide 8 well中的RAW-264.7，經過四天的培養

　　為獲得最佳的分布的勻的細胞，我們建議使用像μ-Slide VI 0.4 這樣的通道載玻片。在8孔腔室載玻片中，細胞密度可能會在孔的整個表面上因點而異，具體取決于細胞播種過程中的處理。

　　5. 免疫熒光染色

　　像往常一樣為您的細胞固定和染色。

　　注意：在 μ-Slides 中染色時注意液體的處理

　　μ-Slide VI 0.4 ：更換液體，先吸出兩個儲液池而不排空通道。 如果您使用的是真空設備，請注意不要將吸頭直接放在通道的入口上。 用100 μl新溶液沖洗通道3次。 從一側添加新的溶液，通過通道流入另一個儲液池，然后從另一側吸出，直到兩個儲液池都排空。注意通道永遠不要干涸！

　　μ-Slide 8孔載玻片：在 μ-Slide 8孔中，無需特殊處理措施。像在任何其他培養皿或孔板中一樣的交換液體。

　　下文中，給出了使用以下材料對細胞核和肌動蛋白絲進行染色的示例：

　　細胞核：DAPI（Diamidino pheylindol dihydrochlorid） SIGMA, 32670 

　　肌動蛋白絲：Phalloidin, Alexa Fluor ? 488 Conjugate, LONZA, PA-3010 

　　1. 用3.7% 的PFA在PBS（pH 7.4）中室溫下固定細胞10分鐘。

　　2. 用PBS清洗細胞三次。

　　3. 用Triton X 100（0.1%）孵育細胞5分鐘。

　　4. 用PBS清洗細胞三次。

　　5. 用1%牛血清白蛋白在PBS中孵育20分鐘。

　　6. 用PBS清洗細胞三次。

　　7. 在0.2μm濃度下用鬼筆環肽Alexa For 488孵育細胞20分鐘。

　　8. 用PBS清洗細胞三次。

　　9. 用DAPI（0.5μg/ml）孵育細胞10分鐘。

　　10. 用PBS清洗細胞三次。

　　11. 完全吸出通道并用ibidi封片劑重新填充。 現在樣品可在顯微鏡上觀察了。保存在陰暗陰涼處可儲存數周。

　　圖7：在 μ-Slide VI 0.4中的RAW-264.7用DAPI（細胞核、藍色）和Phalloidin, Alexa Fluor ? 488 Conjugate（肌動蛋白絲，綠色）

　　1、哪種細胞密度最適合我的實驗？

　　通常，我們建議每孔使用5,000-10,000個HUVEC。 但是，確定最佳細胞數對于使用μ-Slide血管生成從管形成測定中獲得最佳結果是至關重要。 細胞密度取決于細胞類型和細胞大小。 因此，在開始實際實驗之前，我們建議在非抑制條件下播種幾個細胞數并對管形成進行成像。 然后，對于最佳測定條件，使用在您的實驗中產生最多管數的細胞密度。請記住，細胞通常不會在凝膠基質上增殖。請參閱：血管生成實驗實驗裝置優化和數據分析 |ibidi μ-Slide

　　2、應該在哪個時間段內觀察細胞？

　　管形成的持續時間取決于細胞類型和所使用的細胞外基質，應單獨確定。 通常，HUVEC在 2-4小時后已經形成管。24小時后細胞開始發生凋亡，這導致從基質中脫離和管破裂。請參閱：血管生成實驗實驗裝置優化和數據分析 |ibidi μ-Slide

　　3、是否需要活細胞成像裝置來每小時拍攝管形成測定的照片？

　　非必須，通過顯微鏡對 μ-Slide 血管生成上的同一位置進行一致和精確的成像。 可以使用顯示 x/y 坐標的顯微鏡載物臺或自動載物臺來完成成像。 使用自動化平臺，可以將孔的所有位置（特別是每個孔的中心）保存到位置列表中，您可以在每個時間點訪問相應的位置。

　　但是，使用完整的活細胞成像設置在顯微鏡上建立生理條件要方便得多。使用ibidi Stage Top 孵育系統等活細胞孵育裝置有助于在成像過程中提供穩定溫度和濕度條件，從而在體外可以直接進行視頻拍攝。

　　4、是否可以使用 μ-Slide 血管生成在凝膠基質內培養細胞？

　　可以，μ-Slide 血管生成非常適合在精確定義的3D基質中培養細胞。由于大界面的凝膠和頂部細胞培養基，凝膠中的條件可以通過更換上部儲液器中的介質來調整。

　　5、應該在管形成實驗中使用含酚紅的凝膠還是不含酚紅的凝膠？

　　對于使用μ-Slide血管生成的管形成測定中的相差顯微鏡，酚紅不會干擾圖片，并且由于其顏色，處理更容易。然而，當使用熒光顯微鏡時，酚紅可能會干擾探頭的波長。在這種情況下，應該使用無酚紅凝膠。

　　6、是否需要將μ-Slide Angiogenesis血管生成載玻片放入培養箱的濕室中進行凝膠聚合？

　　我們建議將μ-Slide血管生成載玻片放入加濕腔中進行凝膠聚合。 雖然反應室對于聚合本身不是必需的，但它可以最大限度地減少蒸發的影響。 在高流量孵化器中，防止蒸發的足夠百分比的濕度可能不會始終保持一致。 μ-Slide血管生成中的少量凝膠會很快變干，這會導致彎液面的形成。

　　7、胎牛血清 (FBS) / 胎牛血清 (FCS) 濃度是否會影響管形成實驗中的管形成和降解速率？

　　一般是的。 這取決于所使用的細胞類型或細胞系。 當提供濃度高達 10% FCS 的細胞培養基時，我們在 μ-Slide 血管生成中觀察到典型的原代細胞 (HUVEC) 管形成和 Matrigel? 上的幾種內皮細胞系。 但是，我們建議分別優化每個細胞系的 FBS/FCS 濃度。

　　8、您是否推薦使用減少生長因子的 Matrigel? 進行管形成分析？

　　對于使用μ-Slide血管生成的管形成測定，我們使用了減少生長因子的 Matrigel? 和未減少的 Matrigel?。請參閱：腫瘤學必備 | 血管生成實驗介紹

　　9、我們希望使用減少了生長因子的 Matrigel? 和無血清培養基以及 50 ng/ml VEGF。 這足以刺激管的形成嗎？

　　可以，這種組合足以刺激ibidi血管生成實驗室器皿中的管形成，而培養基中沒有任何額外的生長因子。

　　10、除了 Matrigel? 之外，您在試管形成實驗中是否有使用其他凝膠的經驗？

　　原則上，任何凝膠都可用于μ-Slide血管生成管形成實驗。 細胞可以附著在表面上是很重要的。 膠原蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白為細胞粘附提供了重要的結合基序。

　　11、什么是管形成實驗合適的陽性和陰性對照？

　　建議使用陽性和陰性對照來減少管形成實驗中的變量。陽性對照是預期細胞在其中形成血管的樣本（取決于實驗設置），從而向研究人員表明該實驗已正確進行。陰性對照是與所有其他樣品以相同方式處理的樣品，但預計不會顯示任何實驗結果（例如，很少或沒有管形成）。

　　ibidi血管生成實驗室器皿中管形成實驗的最佳陽性和陰性對照很大程度上取決于所使用的細胞、凝膠基質和一般實驗設置。因此，我們建議您查閱文獻，了解您感興趣的主題中成功使用的對照（陽性和陰性對照）。

　　在下文中，您可以找到管形成測定中陽性和陰性對照的可能方法：

　　如果需要分析特定化合物誘導血管生成的效力，則可以使用用已知血管生成誘導劑（例如 VEGF 或 FGF2）處理的樣品作為陽性對照。濃度很大程度上取決于細胞類型和實驗設置。

　　如果使用原代細胞，預篩選的內皮細胞系（例如，HUVEC）在用特定生長因子處理后表現出明確的反應，可以作為陽性對照。

　　對于某些細胞類型，形成管的能力還取決于所使用的凝膠基質。作為陽性對照，內皮細胞應在含有饑餓培養基（不含生長因子或血清的培養基）的生長因子減少的 Matrigel?上顯示管形成。如果需要測試促血管生成物質，則使用饑餓培養基尤其重要，因為大多數細胞培養基都添加了生長因子。為了分析物質的真實效果，基質和培養基都必須不含任何生長因子。作為陰性對照，細胞可以播種在不同的基質（例如膠原蛋白 I）上，預計不會形成管狀。

　　不影響細胞活力的管形成抑制劑（例如，蘇拉明或蘿卜硫素）可用作陰性對照。如果實驗的目的是測試抗血管生成物質，則使用這種類型的抑制劑尤其重要。

　　如果用任何溶解的物質（例如，在 DMSO 或乙醇中）處理細胞，則僅使用溶劑作為陰性對照。

　　12、是否有用于分析管形成實驗的推薦染色方案？

　　一般來說，相差顯微鏡足以自動分析 μ-Slide血管生成中的標準管形成實驗。 但是，如果您想研究某種標記，您可以應用您的標準方案（例如，用于免疫熒光染色），但要小心，以免損壞凝膠基質或細胞網絡。

　　使用calcein的染色方案示例可參閱：腫瘤學必備 | 血管生成實驗介紹

　　13、在開始實驗之前，我是否必須將 ibidi 血管生成實驗室器皿平衡到 37°C？

　　不，不需要平衡 μ-Slide 血管生成。 在室溫下儲存，可以立即用凝膠基質填充。 由于μ-Slide 的開孔形式，加熱時從凝膠中逸出的氣體可以與大氣自由交換。

　　14、完成實驗后，μ-Slide Angiogenesis和μ-Plate Angiogenesis 96 Well可以重復使用嗎？

　　不可以，μ-Slide血管生成載玻片和μ-Plate血管生成96孔板是一次性耗材，僅供一次性使用。

　　15、μ-Slide 血管生成是否有96孔版的？

　　有。 μ-Plate血管生成96孔板具有與μ-Slide血管生成相同的“孔中孔”設計和凝膠體積 (10 μl)。 μ-Plate血管生成96孔可用作高通量管形成實驗的篩選板，具有完全的ANSI/SLAS (SBS) 和robotics兼容性。

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一、7510高性能萬用表的主要特點及優勢：

二、7510高性能萬用表應用

應用1：瞬態小電流

物聯網模塊、低功耗器件、低功耗IC電流分析

優勢：

1、測量精度高，7 ?測量，100pA精度

2、采樣率高：1MS/s，實時性強

3、長時間記錄數據：大于24小時

4、圖形觀察，數據記錄，數據統計

5、CCDF結果

6、性價比高

應用2：電壓穩定性測量

電池OCV的電壓穩定測量，廣泛應用于電池生產流程的電壓參數階段。

目前，電池廠家以及提供電池充放電設備的廠家，普遍把電池電壓的精度定為1mV,哪種萬用表能滿足標定這樣的要求呢？上圖對比了6?和7?數字萬用表測量18650電池的結果，明顯看出，7?才是Z佳選擇，DMM7510是滿足行業要求的高精度數字表。

應用3：電壓、溫度測量

電池EOL下線檢測

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應用4：類似應用

如果要測量3.8958V電壓，精度要求達到0.1mV,你必須選擇 7?萬用表。

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1、Culture-Inserts插件可以重復使用嗎？

盡管 Culture-Inserts 插件中的材料可高壓滅菌并且與酒精相容，但我們不建議重復使用。 如果您仍想嘗試重復使用，則需要建立一個用酸或堿的清潔程序。 ibidi沒有任何清潔Culture-Inserts插件的經驗，雖然它們可能會保持粘性，但之前實驗的殘留可能會影響重現性。 

2、可否在蓋玻片上使用 Culture-Inserts插件嗎？

可以，您可以在任何蓋玻片上使用 Culture-Inserts插件。 到目前為止，還沒被報告與任何干燥表面不相容。 

3、是否可以使用 Culture-Insert 插件制作小于 500 μm 的傷口？

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不可以，Culture-Inserts 插件中最小和標準的傷口尺寸是 500 μm。 Culture-Insert 4 Well /4孔插件會有一個額外的中心間隙，傷口大小為 1000 μm。

3的圖片

4、Culture-Insert 插件是如何固定在培養皿上的？

Culture-Insert 插件由生物相容的硅膠材料制成。 硅膠底部有一個粘性表面，可粘附（粘）在任何平坦、干燥、均勻的表面。 這種材料足夠柔軟可粘到表面上。 您可以用無菌鑷子按壓插件來簡單地修復它。

4的圖片

 5、您是否曾經遇到過 Culture-Inserts 插件無法粘附在定制涂層表面上的問題？

只要表面干燥，我們從未遇到過讓 Culture-Inserts 插件粘附在定制涂層表面上的任何問題。 但是，潮濕的表面會導致泄漏。 因此，請確保您的定制涂層表面完全干燥。

6、需要在 Culture-Insert 插件中播種多少個細胞才能進行細胞遷移實驗？

圖片

開始遷移實驗時，Culture-Insert 插件中的細胞層應融合。 在所有實驗中，匯合細胞層的密度應盡可能一致。 使用的接種細胞數量取決于您的細胞類型，因此您可以在 Culture-Insert 2 Well 說明書中找到推薦的范圍和詳細方案。 

7、為什么移除 ibidi Culture-Insert 插件后細胞有時會從蓋玻片上脫落？

以下是解釋細胞脫離的一些可能原因：

? 細胞密度太高。 --> 播種更少的細胞（細胞層應在 24 小時后生長至 100% 融合，但不能過度生長）。有關傷口愈合試驗的詳細方案，請參閱：傷口愈合／細胞劃痕實驗新方法－如何劃出筆直均一的劃痕（這是個鏈接2020-12-10發布的公眾號）

? 細胞正在挨餓。 --> 增加每個插入孔的培養基體積，或在細胞生長期間更換培養基。

? 在極少數情況下，細胞類型不能很好地粘附在 ibiTreat 表面。 --> 首先，覆蓋蓋玻片表面以促進細胞附著。然后，在插入 ibidi Culture-Insert 插件之前讓涂層干燥。

以下是使用帶有涂層的 ibidi Culture-Inserts 插件以促進細胞粘附的一些額外提示：

? 我們強烈建議提前測試移除ibidi Culture-Insert 插件是否會破壞遷移間隙中的涂層。這可以通過使用針對涂層蛋白的熒光標記抗體進行分析。如果遷移間隙區域中涂層的熒光信號與開放孔中的一樣均勻和強烈，則可以假設在插入物移除后是保持完好的。經過幾次成功的測試后進行實際實驗通常是安全的。

? 如果去除插入物破壞了大部分涂層，則僅涂覆插件的孔，然后接種細胞。取出插件后，通過向培養基中添加低濃度涂層來填充間隙并孵育約 30 分鐘。之后，用普通介質替換涂層溶液并繼續進行遷移實驗。

7的圖片

8、當 Culture-Insert變干燥時，包被蛋白會失去活性嗎？

這主要取決于與 Culture-Insert 插件一起使用的蛋白質類型。 使用層粘連蛋白的人通常更喜歡在涂層和細胞接種之間保持水分。 根據我們的經驗，當纖連蛋白和膠原蛋白 IV 干燥時，我們沒有發現對細胞遷移速度有任何影響。 

9、有沒有辦法用懸液細胞進行傷口愈合實驗，或者該實驗僅適用于貼壁細胞？

目前，使用 Culture-Insert插件的傷口愈合實驗只能用于貼壁細胞。 然而，單個細胞的遷移研究可以在 μ-Slide 趨化性中通過將細胞嵌入到3D基質（例如，I 型膠原蛋白凝膠）中進行。 

10、是什么使 Culture-Inserts插件在細胞接種過程中不會泄漏？

Culture-Insert 插件由硅膠材料制成。 上部是粗料，下部是非常柔軟的材料，在按下 Culture-Insert 插件后會固定在表面上。 正確插入時是不會有任何泄漏的。 

11、該如何存儲 Culture-Inserts插件？

請在室溫下儲存 Culture-Inserts。 打開過的產品應儲存在無菌容器中。 

12、有時很難在 Culture-Insert 插件中看到細胞層的匯合。 您有什么建議？

當使用相差顯微鏡和小孔時，例如 Culture-Insert 插件或 96 孔板，空氣-水界面之間的彎月面會導致表面強烈彎曲。 這會破壞除孔中心以外的任何地方的相位對比效應。

一種解決方案是用細胞培養基完全均勻地填充 Culture-Insert 的兩個孔。 通過這樣做，您可以在孔上方的介質和空氣之間創建一個平面。 請記住，這可能會導致兩孔之間的交叉污染。

13、有時，細胞傾向于聚集在 ibidi Culture-Insert插件的邊緣。 怎樣才能避免這種情況？

當細胞在 Culture-Insert插件中生長到非常高的密度時，會觀察到了這種情況。 為了減少細胞團塊，您應該在實驗開始時使用較低的細胞密度。 然而，有時細胞會粘在與細胞相容的硅膠上。 在這種情況下，我們建議較少孵育時間和/或細胞數量。 

14、Culture-Insert 如何在不造成細胞損傷的情況下模擬生理傷口？

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使用體外實驗時，很難以可重復的方式模擬生理傷口。 當然，來自死細胞的碎片可能在與傷口愈合相關的遷移中發揮作用。 使用 Culture-Insert插件的 ibidi 傷口愈合實驗提供了可重復的、無損傷的細胞貼片。

在體內，各種其他參數對傷口愈合的影響更大，例如不同細胞類型的相互作用。 使用 Culture-Insert插件的體外 ibidi 傷口愈合實驗將遷移速度與所有這些其他影響分開，提供了一個客觀且可重復的實驗環境。

15、用Culture-Insert插件產生間隙時細胞是否會受損？

Culture-Insert 插件將細胞彼此分離，而不會產生傳統意義上的傷口（例如，在劃痕實驗期間）。 目的是在不產生大量受傷細胞的情況下產生間隙，然后研究間隙閉合。該技術使用戶能夠將細胞的遷移行為與細胞損傷區分開來。 

16、 Culture-Inserts 插件能否用于蛋白質涂層表面？ 拔出 Culture-Insert 插件會干擾涂層嗎？

一般來說，只要涂層干燥，Culture-Insert 產檢可以放置在涂層表面上。 請注意，插件不會黏附在潮濕的表面上。

但是，我們強烈建議您提前測試插件移除是否會破壞遷移間隙中的涂層。 您可以使用針對涂層蛋白的熒光標記抗體來分析這一點。 如果遷移間隙區域的涂層發出的熒光信號與開放孔中的一樣均勻和強烈，那么您可以假設在移除插件后涂層是保持完好的。 經過幾次成功的測試后進行實際實驗通常是安全的。

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　　該應用描述了一種在流動下的粘附試驗，該試驗旨在研究特定細胞表面分子的作用，以確定它們在細胞附著和粘附到其他細胞類型期間的潛在相互作用。

　　對于我們的方法，我們使用預染色的鼠腫瘤細胞（多發性骨s瘤：MM）和鼠內皮細胞（EC），然后使用單克隆抗體阻斷我們感興趣的分子之一。簡而言之，將EC接種到ibidi通道μ-SlidesI0.6mmLuer中，并在恒流下培養24小時。為了開始共培養，將標記的MM細胞添加到流動容器中并繼續流動。24小時后，用抗體（以阻斷感興趣的分子）或相應的同種型對照處理裝置，并保持流動24小時。第二天，將μ-Slides與流體單元(FU)斷開并清洗以去除非粘附的MM細胞。為了分析標記的MM細胞對EC的粘附，使用共聚焦顯微鏡獲得了μ-Slides的熒光圖像。

　　1. 材料和試劑

　　?MOPC多發性骨s瘤(MM)細胞系(ATCC,TIB-23?)

　　?EOMA內皮細胞(EC)系(ATCC,CRL-2586?)

　　?含10%FCS的RPMI培養基（FisherScientific，11530586）

　　?內皮細胞生長培養基（EC培養基、CellBiologics、M1168）

　　?PBS（泛生物技術，P04-361000）

　　?非酶細胞解離溶液（Sigma-Aldrich，C5914-100ML）

　　?臺盼藍溶液（Sigma-Aldrich，93595）

　　?CellTracker?綠色CMFDA染料（ThermoFisher，C7025）

　　2. 設備和設置

　　?帶有2個流體單元(FU)的ibidi泵系統，每個單元都帶有用于2ml儲液罐的支架（ibidi，10977）

　　?ibidiμ-SlideI0.6mmLuer，ibiTreat（ibidi，80186）

　　?ibidiPerfusionSet藍色，15厘米，內徑0.8毫米（ibidi，10961）

　　?ibidi過濾器/儲液罐套裝，2毫升（ibidi，10972）

　　?帶細胞培養設備的層流罩

　　?培養箱（所有培養步驟均在37°C和5%CO2下進行）

　　?帶有適當濾光片組和照相機的熒光顯微鏡

　　?粘度：0.0072(dynxs)/cm2

　　3.實驗流程

　　1.準備EOMA細胞稀釋液：根據制造商的說明，使用非酶細胞解離溶液分離先前培養的EOMA細胞。使用血細胞計數器（Neubauerchamber）對細胞進行計數。在EC培養基中將細胞稀釋至1.2x106個細胞/ml的濃度。

　　2.種入EOMA細胞：在3個 μ-SlidesI0.6mmLuer（ibidi，80186）中加入150μlEOMA細胞稀釋液（每個μ-Slide1.75x105EOMA細胞），然后孵育3小時。

表1：實驗設置

　　3.啟動流量：播種三小時后，將2個μ-Slides連接到流體單元FU，使用總量2.7毫升EC培養基。在8.2mbar的壓力下將EOMA細胞表面的剪切應力設置為0.5dyn/cm2。測量流速并使用兩個FU的平均值來計算校準因子。提前孵育FU和連接的載玻片過夜。第三個帶有EOMA細胞的μ-Slide用作靜態控制。在沒有任何流動的情況下孵育它過夜。

　　4.準備MM細胞：根據制造商的方案，用CellTrackerGreen(CMFDA)染料在600μlRPMI培養基（不含FCS）中染色6x105MM細胞。標記后，離心細胞并使用血細胞計數器對其進行計數。

　　5.開始與MM細胞共培養：停止流動并在無菌條件下從FU水庫中取出EC培養基。要開始共培養，將RPMI培養基（含10%FCS）和EC培養基以1:1的比例混合，并填充該混合物總體積為2.5ml，其中含有1.5x105MM注入兩個FU儲液罐。將FU重新連接到泵系統并繼續流動24小時。

　　6.分子阻斷：將MM細胞添加到ECs后24小時，用100μg/ml抗體（載玻片 #2）或相應的同種型對照（載玻片 #1）處理細胞，將它們直接添加到FU，無需更換介質。將孵育保持在流動狀態下24小時。

　　7.清洗和成像：從FU上斷開μ-Slides。用PBS清洗細胞一次，以去除任何非貼壁細胞。使用共聚焦顯微鏡獲取熒光圖像，以可視化附著在EC層上的標記MM細胞。

圖1：與同種型對照處理（左圖）相比，阻斷特定表面分子（右圖）時，MM細胞對ECs的粘附性降低

　　1.介紹

　　本應用逐步說明了如何串聯連接多個Luer-Slides。優點是僅使用一個流體單元即可觀察和培養多個載玻片。當使用相同規格的載玻片時，載玻片中的流速是相同的。也可以通過連接不同高度的載玻片來改變剪切速率（例如，μ-Slide I0.2Luer和μ-Slide I0.4Luer）。

　　本次介紹了兩個載玻片連接的過程。但是它可以應用于大量的載玻片。

　　2.材料

　　載玻片：2片 μ-Slides I 0.6Luer, ibiTreat                ibidi (80186)

　　細胞：Endothelial cells (2.5 · 105 per slide)          e.g. Promocell

　　培養基：Endothelial Cell Growth Medium            e.g. Promocell

　　連接器：Serial Connector                                      ibidi (10830)

　　注射器：帶簡單Luer適配器的無菌注射器（5 ml）

　　串行連接器：

　　管道：Silicone Tubing 1.6 mm ID                           ibidi (10842)

　　適配器：Luer Connector Male                                 ibidi (10824)

　　將一個塑料連接器插入通道載玻片的兩端（6厘米），以在載玻片之間連接起來。下圖是在兩端帶有兩個配套的Luer公接頭的連接器管。可用乙醇或高壓滅菌消毒接頭。

必須在無菌條件下執行以下步驟！

　　3. 播種細胞

　　· 準備1.67 · 106 cells/ml.的細胞懸液。

　　· 將150 μl注入通道。僅填充通道體積（圖1a）。

　　· 將帽蓋在Luer接頭上，并將載玻片放在培養箱中培養半小時來固定細胞。

　　· 細胞固定后，將兩邊儲液接口各加60 μl充滿。

　　4. 連接載玻片

　　現在準備載玻片，使細胞在通道中生長，并向儲液池中填充60 μl無細胞培養基（請參見第3節）。

　　· 在連接之前，將所有儲液器各加60 μl（圖1b）。

　　· 將連接器管的一個Luer適配器插入載玻片的一個母Luer適配器中（圖1c）。

　　· 將一些預備的培養基吸入注射器。倒轉注射器并將多余的空氣推出（圖1d）。

　　· 使用沒有氣泡的注射器在載玻片端口注入。可能會有些溢出（圖1e）。

　　小心地將液體注入載玻片，直到連接器管中充滿為止（圖1f）

　　圖1：（a）接種細胞時的用量； （b）載玻片在連接之前已完全填滿； （c）載玻片中插入連接管； （d）無氣泡的注射器； （e）將注射器插入載玻片一端； （f）用注射器推動介質來填充連接器管道

　　· 當連接器管道完全充滿時（圖2a），將其插入第二張載玻片的接口上（圖2b-d）。

　　· 如果要連接兩個以上的載玻片，將第二個連接器管放在第二個載玻片空的另一端口上，用注射器推入介質，依此類推。

　　· 慢慢連接的所有載玻片將注射器從適配器上卸下（圖2e）。

　　· 要將載玻片連接到灌注套件，兩個Luer容器必須在頂部填充培養基。可用紙巾擦去過多的培養基。

　　圖2：（a）連接管已完全充滿； （b-c）將連接器管插入第二載玻片的魯爾接頭上； （d）帶有適配接頭管連接； （e）取下注射器； （f）擦去溢出的介質，并填充儲液罐以連接到灌注套件。

　　5. 連接到灌注裝置

　　將載玻片連接到灌注套件

　　圖片串聯安裝帶有兩個μ-Slides I Luer的一個流體單元

AnielloFederico*,JochenUtikalSkinCancerUnit,GermanCancerResearchCenter(DKFZ),69120Heidelberg,Germany.*Correspondingauthor.E-mailaddress:a.federico@dkfz-heidelberg.de

為了研究腫瘤微環境影響下腫瘤細胞的運動性和侵襲特性，建立了體外2D侵襲方案。這種2D侵襲方案是一種共培養試驗，在這種情況下，是由腫瘤和基質細胞（例如成纖維細胞）組成的。一旦兩種細胞類型接觸，在不同的條件下評估侵襲成纖維細胞單層的腫瘤細胞的數量，在我們的研究中，我們在模擬實體腫瘤微環境中發現的條件，例如與基質細胞（成纖維細胞）的相互作用以及成纖維細胞釋放的可溶性因子（Nnetu等，2012）。我們使用A375黑色素瘤細胞系和真pi成纖維細胞進行了此測定。黑色素瘤細胞激活成纖維細胞，繼而維持腫瘤細胞的生長，惡性轉化和耐藥性（Flach等，2011）。然而，在刺激所測試的抗ai化合物后，我們發現與成纖維細胞直接接觸的黑素瘤細胞顯示出運動能力受損并且未能侵襲成纖維細胞層。

材料和試劑

1. GFP-A375細胞系（ATCC）

2. 番茄皮成纖維細胞（從健康患者中分離）

3. MEF細胞培養基

4.PBS（Sigma-Aldrich；D8537）

5.胰蛋白酶-EDTA溶液（Sigma-Aldrich；T3924）

6. 臺盼藍溶液（Sigma-Aldrich;93595）

7.DMSO（CarlRoth;A994.2），在0.1％最終濃度下使用

8.MithramycinA（BioTrend；10-2085-5mg），在300nm濃度下使用，用DMSO稀釋

儀器設備

1. 層流凈化罩

2. 12/24孔多孔板（GreinerBio-One）

3. 臺式離心機

4. 細胞計數器

5. 2孔插件（ibidi: 80209）/預置2孔插件培養皿（ibidi:81176）

6.細胞培養管

7. 渦旋

8. 鑷子

9. 光學顯微鏡

10. 熒光顯微鏡

11. NIS-Elements軟件

ibidi:81176

實驗流程

01. 將GFP-A375和番茄成纖維細胞系穩定地保存在MEF培養基中，在37°C和5%C02加濕培養箱中。

02. 當細胞達到亞融合度（約80％融合度）時，在帶有PBS的通風櫥中清洗它們，以去除死細胞和碎片。

03. 在培養箱中用胰蛋白酶-EDTA溶液胰蛋白酶消化細胞約5分鐘，然后添加MEF培養基以阻止反應。

04. 將細胞懸浮液收集在15ml細胞培養管中，并用臺式離心機（1500xg,5′,RT）短暫離心。

05. 將細胞重新懸浮在新鮮培養基中；將一體積的細胞懸液與另一體積的臺盼藍溶液混合，用細胞計數器計數活細胞。

06. 在MEF緩沖液中以4x105細胞/ml的濃度稀釋細胞。

07. 在多孔板上，在每個孔的中間放置一個Culture-Insert2孔（2孔培養插件）。

08. 用75μl（3x104細胞）FP-A375細胞填充插入物一側，并用番茄成纖維細胞填充另一側。用移液器上下混合插入物中的細胞，以確保細胞完全分布。

09. 將多孔板放在培養箱中，放置過夜。

10. 第二天，在鑷子的幫助下，小心地從每孔中取出培養基和插件，并用PBS清洗。

11. 小心除去PBS，然后加入新鮮的MEF培養基。

12. 用光學顯微鏡檢查GPF-A375與Tomto成纖維細胞之間產生的間隙的閉合狀態。

13. 一旦每個孔中的間隙完全閉合，請使用熒光顯微鏡和成像軟件獲取熒光圖像。確保腫瘤細胞尚未侵入成纖維細胞單層。

14. 小心地除去培養基，并在控制組孔中添加培養基+0.1％PBS，在處理組孔中添加培養基+300nM絲裂霉素A。將板放在培養箱中24小時（處理孵育時間）。

24小時后，在熒光顯微鏡下重新采集共培養孔，以評估治療組與對照組（綠色熒光細胞散布在紅色標記層上）的腫瘤細胞侵襲行為的任何變化（圖2）。

圖1：2D侵襲系統的示意圖

圖2：2D侵襲檢測的熒光圖像

將黑素瘤細胞和成纖維細胞共培養，然后暴露于300nmMithramycinA（或DMSO）。24小時后，評估侵襲成纖維細胞層的腫瘤細胞的數目。A375細胞顯示出大規模的侵襲行為，受到MithramycinA治療的損害。比例尺：500μm。

備注：

1.此處描述了MEF培養基組成（參考文獻1）。

2.此文僅供參考。

3.此實驗方案來自ibidi的實際用戶，更多詳情可聯系本文作者。

參考文獻：

1.MithramycinAandmithralogEC-8042inhibitSETDB1expressionanditsoncogenicactivityinmalignantmelanoma. FedericoA,SteinfassT,LarribèreL,NovakD,MorísF,Nú?ezLE,UmanskyV,UtikalJ.MolelucarTherapy-Oncolytics2020;doi: https://doi.org/10.1016/j.omto.2020.06.001 (Methoddescribedinthisprotocolwasincludedinthispublishedarticle).

2.Theimpactofjammingonboundariesofcollectivelymovingweak-interactingcells. NnetuKD,KnorrM,K?sJ,ZinkM.NewJournalofPhysics2012;doi:https://doi.org/10.1088%2F1367-2630%2F14%2F11%2F115012

3.Fibroblastscontributetomelanomatumorgrowthanddrugresistance. FlachEH,RebeccaVW,HerlynM,SmalleyKS,AndersonAR.Molecular pharmaceutics2011;doi:10.1021/mp200421k

近期，很多用戶咨詢吉時利數采2700，但2700已經停產，吉時利推出的DAQ6510 數據采集和記錄萬用表系統 具有觸摸屏用戶界面，可在儀器上更快完成設置、實時監控測試狀態以及分析詳細數據，從而實現前所未有的簡單性，今天安泰測試就帶大家全面了解一下DAQ6510的主要特點和應用：

一、DAQ6510數采/開關系統的主要特點及優勢

二、DAQ6510數采/開關系統典型應用

應用1：溫度測量

輕松進行環境測試和加速的使用壽命測試

泰克的特點和優勢：是少于80CH的，可以使用觸摸屏顯示器快速設置有統計意義的設備數量的測試。在測試過程中監視測試狀態。在觸摸屏上查看圖形或表格形式的數據。

也可以使用KICKSTART軟件來電腦控制記錄和顯示。并存儲大量的數據。

應用2：小電阻測量

經濟GX地測試低值電阻組件

使用 DAQ6510 準確、可靠地測試電纜、低值電阻和連接器等組件

應用3：多參數測量，電壓/溫度

增強測試能力并提高吞吐量

使用 DAQ6510 可以增加單個測試系統的設備數量，并zui大限度提高測試能力。利用 DAQ6510 縮短測量時間和加快掃描速率。

應用4：電池PACK參數測量

新能源的發展，使電池的產量越來越大，評估電池的電壓、溫度等參數越來越多

應用5：配套其它儀器做更多參數測量

DAQ6510可以配合內阻表或者SMU源表對有源器件如LD、LED等進行綜合參數測量。

如果大家有以上應用，不妨可以了解一下DAQ6510，如需了解DAQ6510更多產品信息，歡迎訪問安泰測試網。

      高品質的熒光顯微鏡是臨床實驗室完成間接免疫熒光檢測的必備實驗條件。目前，大部分臨床實驗室的熒光顯微鏡還是采用傳統的汞燈作為光源。為了提高臨床檢驗的工作效率、改善檢測環境，廣州明美推出了一整套的LED熒光顯微鏡和顯微成像系統解決方案。該解決方案包括LED熒光顯微鏡和顯微成像系統。

相對于傳統汞燈光源， LED光源具有的優勢
1.特定的LED光源發射特定波長的激發光，能夠更有效的激發樣品；非紫外LED不存在紫外輻射，高度確保使用者的安全。
2.超長的使用壽命（50,000小時），是傳統汞燈的250倍，極大地延長了顯微鏡壽命、降低實驗成本；且在壽命內輸出強度、波長穩定，確保激發的有效性。
3.實時開關，不需要預熱、冷卻。獨特的LED系統，納米級的響應時間，打開電源開關后可以立即達到全功率輸出，實時開關不會影響到光源。
4.LED安全性高、冷光源、體積小，可隨意搬動，不存在汞泄露污染、發燙問題。
5.使用過程中，無需光路調節。
6.攜帶亮度調節旋鈕，避免過高亮度引起的熒光淬滅。
7.可選配便攜式移動電源，隨意移動，突然停電也不會影響使用。

MF-LED熒光附件

MF-LED熒光模塊的推出，為免疫熒光實驗室熒光顯微鏡解決方案提供了一種可能。借助LED熒光模塊，可輕松地將一臺無限遠光學系統的普通顯微鏡轉化為模塊化的、節能GX的、易于操作和超長壽命的熒光顯微鏡，實現GX的熒光觀察。

間接免疫熒光檢測用MF-LED的主要參數如下：

MSHOT 顯微成像系統

間接免疫熒光檢測自身抗體時，可觀察到各種不同的熒光核型和表現，廣州明美為熒光檢測/觀察提供了專業的顯微數碼成像系統—MC系列/MD系列。借助這些高分辨率、高清晰度、高像素、高靈敏度的成像系統，可實現實時捕獲各種清晰的熒光圖像，以做檢測結果記錄、典型案例討論、核型判讀教學等。

左圖：明美MF-B-LED搭配Olympus CX22顯微鏡主機（含物鏡）、明美三檔三目分光器件、明美數碼相機MC20-N組成的熒光解決方案；右圖：該熒光解決方案的拍攝效果圖。

（來源：廣州市明美光電技術有限公司）