根據NCBI的ClinVar數據庫統計，包括罕見疾病，如鐮狀細胞病、地中海貧血和先天性萊伯黑朦等超過3萬7千種已知疾病與致病性單核苷酸變異（SNV）有關，SNV可能導致原始DNA序列、轉錄水平和蛋白質序列等其他特性的變化。而新一代CRISPR/Cas9技術——堿基編輯器（BEs）可以有效地修復堿基突變，而不會誘導雙鏈DNA斷裂，從而能夠直接、不可逆地校正堿基突變，對于治愈SNV引起的遺傳疾病具有十分廣闊的前景。已經報道的有誘導C·G到T·A轉化的胞嘧啶堿基編輯器（CBE）、誘導A·T到G·C轉化的腺嘌呤堿基編輯器（ABE）和使C·G到G·C轉換的糖基化酶堿基編輯器（GBE），這些BEs為治 療50%以上致病性SNV提供了幾乎理想的解決方案。

然而，在實施基于BE的基因療法之前，有必要大量構建具有致病性SNV的細胞疾病模型，以用于開發和優化BEs，并使其在基因治 療中的應用成為可能。同時，根據ClinVar的數據，大約50%的人類致病性SNV是C·G到T·A的轉化，然而目前很難通過合理的人力和資金投入獲得大量攜帶這些SNV的細胞模型。這一方面是由于大規模樣品，手動操作不僅耗時，而且容易出錯，一致性較差且成本高昂；另外一方面，現有的基于目標-位點集成庫的方法，如Be-Hive等在為AI學習和預測編輯性能的數據時，缺乏原位信息的綜合編輯位點數據，同時又缺少真實染色體環境（先前研究表明，核酸酶的性能與染色質可及性之間存在很強的相關性，并且基因編輯在真核染色質中比異染色質中更有效）。

中科院天津工業生物技術研究所和天津科技大學的團隊，開發了一個由以下四個模塊組成的用于哺乳動物細胞高通量原位基因編輯的自動化平臺，實現了哺乳動物細胞基因編輯的標準化和可拓展性。

（1）內源性靶gRNA計算機輔助設計；

（2）gRNA表達質粒構建；

（3）哺乳動物細胞堿基編輯；

（4）CBEs性能模型構建的機器學習。

四個模塊組成的用于哺乳動物細胞高通量原位基因編輯的自動化平臺，實現了哺乳動物細胞基因編輯的標準化和可拓展性。該平臺借助大規模的原位編輯數據和序列信息，結合局部染色質可及性，具有原位數據的機器學習模型能夠更好地預測實際的堿基編輯效率，使獲得內生目標的大規模編輯數據集成為可能。

圖1 全自動高通量哺乳動物基因編輯平臺概覽

在這四個模塊中，第 一個模塊用于負責gRNA設計，以將人類致病性SNV引入野生型細胞，作者使用生物信息學分析選擇了1210個基因作為靶位點，使用包含每個靶位點上游3 bp至下游750 bp靶區的DNA序列，分批處理用于分析編輯結果的三對引物。對于自動化gRNA質粒構建工作流程模塊，gRNAs質粒構建過程中采用了貝克曼庫爾特Echo納升級聲波移液系統用于操縱DNA組裝反應，相對于標準的Golden Gate DNA組裝方法的反應體積為15μl，Echo的納升級和無吸頭操作能夠對實驗步驟進行一系列優化，將反應系統最小化到1微升的總體積，從而顯著降低了實驗成本。

隨后使用貝克曼庫爾特Biomek i7自動化移液工作站將DH5α感受態細胞與Golden Gate產物進行混合，通過ClonePix進行轉化鋪板，并在通過DNA測序驗證構建質粒之后，使用Biomek i7進行質粒提取。為了分析數據編輯結果，使用Python腳本讀取sanger測序文件，比較N20，并創建兩個參考csv文件。錯誤的組裝csv文件包括一個選擇列表，用于從48孔細菌菌落板到96孔深孔板中挑選新菌落，以便ClonePix進行另一輪驗證。正確組裝csv文件包含N20測序及其在96孔深孔板中的位置，用于使用貝克曼庫爾特Biomek i7自動化移液工作站進行質粒提取。此模塊高通量自動化系統在4天之內共構建和分析了1210個gRNA質粒，成功率達99%，實現了每天384個gRNA組裝的通量。而后續使用Biomek i7進行的質粒提取，通量則可達到576個質粒/天。

圖2 全自動gRNA質粒構建工作流程概述示意圖

第三個模塊是哺乳動物細胞中的堿基編輯，如圖3。通過優化實驗條件，作者開發了使用Biomek i7自動化移液工作站進行包括細胞接種和轉染、細胞培養基更換以及進行樣品收集在內的編輯過程。隨后進行靶區域的細胞裂解和PCR擴增。全自動高通量系統在6h內將1210組gRNA和BE4max質粒共轉染到HEK293T細胞中，并在2 h內完成后續培養基更換。培養5天后，收獲編輯的細胞于8小時內完成進行PCR分析，然后進行sanger測序。使用Python腳本產生3個csv文件，一個用于準備新一輪PCR的挑選列表，以分析使用Biomek i7從96孔裂解樣品板到96孔PCR板的false sample；第二個csv文件包含用于分析false sample的第二個引物對的序列和位置信息，用于新一輪PCR；第三個csv文件包含正確的樣本和編輯效率結果，用于下一步的AI學習。

圖3 自動化基因編輯過程的工作流程概述

第四個模塊為作者開發的AI模型——染色質可及性學習模型（CAELM），預測基礎編輯的結果。CAELM基于自動化平臺生成的高度均勻的原位基因組編輯數據，預測HEK4T細胞中的BE293max行為，并實現了0.64的皮爾遜相關值。皮爾遜r是評估數值數據模型準確性的最普遍指標之一，CAELM模型中考慮了目標序列的真實染色體環境，這提供了更好、更現實的預測；同時，CAELM還提供了模型輸入的特征重要性得分，并揭示了DNA可及性相對于目標序列上下文的貢獻在預測中接近1:6。

通過與32個不同基因組位點的手動操作進行比較，其中16個目標位點在兩個操作過程中的編輯效率幾乎相等，而自動化高通量系統在其他14個位點的統計分析中表現出更高的編輯效率。這些結果表明，自動化高通量系統能夠以與手動操作相當的效率執行基礎編輯；隨機選擇BE4max編輯靶標的1210個與疾病相關的SNV的編輯效率均達到了較高水平，說明可以同時有效地操縱數千個內源性靶位點的人類細胞的全自動高通量原位基因編輯平臺的成功建立。

● 機械生物學細胞反應

   允許對受限制的細胞進行高級分子和形態分析

● 精確的機械刺激

   通過實時調整限制來觸發機械刺激

● 標準細胞培養板

   兼容35 mm培養皿和平面

● 易于使用

   通過即插即用方式快速進行實驗設置

機械生物學套裝包含壓力控制器和細胞限制器，以更好地模擬體內細胞培養條件。Elveflow的Cobalt自動壓力泵產生穩定的壓力，而4D Cell的細胞限制器提供對培養微環境的測微控制。

細胞壓縮和空間控制的結合提供了對受限空間和機械應力下細胞行為的洞察，增加了體外細胞分析的轉化價值。

機械生物學研究的優勢

1、控制壓力和物理空間：機械應力分析的理想選擇

2、允許在不同的壓力設置之間快速切換：用于實時觀察細胞對機械刺激的反應

3、穩定和無脈沖壓力：對細胞壓縮的全面和穩定控制

4、非破壞性細胞分析：回收您的細胞以便進行分子分析

5、瞬時啟動和停止壓力：快速觸發和釋放約束限制

應用領域

● 細胞限域測定

● 動態細胞行為

● 細胞遷移和癌癥轉移

● 機械轉導

● 細胞遷移可塑性

● 細胞對機械應力的反應

● 活細胞成像

● 細胞分裂

● 機械誘導的細胞修復

● 細胞分裂過程中的基因組不穩定性

● 傷口愈合和炎癥研究

● 細胞包埋

有用介紹鏈接

使用微流體保護DNA免受機械應力：here 

機械細胞壓縮：here

機械生物學套裝包含的組件

微流體的驚人優勢可應用于許多細胞和生物學灌注實驗與應用。因此，可以調整套裝內的組件以滿足您的特定需求。

● 1×Cobalt自動微流體泵

● 1×安全儲液罐

● 3×4Dcell Confiner（PDMS吸盤）：PDMS環形模板 - 將細胞的播種區域劃定到施加限制的區域；

● 12×Confinment slides（限制片）：（1）包含PDMS微結構（支柱）的10mm直徑玻璃蓋玻片；（2）限制高度從1到20μm（您可以為您的套件選擇多達3個不同的高度參數）；

● 1×導管和連接件套裝

● 3×PDMS環形模板 - 將細胞的播種區域劃定到施加限制的區域