導(dǎo)讀

超微量分光光度計(jì)常用于核酸純度分析、蛋白定量以及細(xì)菌生長(zhǎng)濃度的定量，蛋白質(zhì)重復(fù)性不好是我們遇到的最多的問(wèn)題。

今天，我們從超微量分光光度的測(cè)樣原理來(lái)分析一下這個(gè)問(wèn)題。

一般來(lái)說(shuō)，在進(jìn)行超微量分析時(shí)，需要用移液槍將1-2 μL的蛋白質(zhì)樣品加到樣品臺(tái)上。

利用蛋白質(zhì)的表面張力，采用樣品拉伸原理，使樣品形成液柱，從而進(jìn)行檢測(cè)。

殊不知這個(gè)過(guò)程就是影響蛋白質(zhì)測(cè)定準(zhǔn)確性和重復(fù)性不好的關(guān)鍵因素，幾乎可以影響到蛋白質(zhì)表面張力的因素都可導(dǎo)致其測(cè)試結(jié)果的不穩(wěn)定。

現(xiàn)將這些因素總結(jié)如下：

元析B-600超微量分光光度計(jì)主機(jī)

B-600超微量分光

光度計(jì)蛋白質(zhì)測(cè)量方法界面

01

溫度導(dǎo)致樣品揮發(fā)

首先，液體的溫度與分子間引力有一定的關(guān)系。

溫度升高，分子間引力將減弱，表面張力也會(huì)隨之降低。這也解釋了為何低溫保存的核酸樣品，更易形成液柱。

所以，要得到理想的測(cè)試效果，首先要確保實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的溫度和濕度，要預(yù)防儀器本身的發(fā)熱對(duì)樣品的影響。

然而，一款擁有封閉式點(diǎn)樣臺(tái)的超微量分光光度計(jì)可避免這一問(wèn)題。

02

鹽

無(wú)機(jī)鹽作為一種非表面活性劑，具有水合作用，趨向于把水分子拖入水中,因此會(huì)增大表面張力，反之亦然。

因此，脫鹽或低鹽的樣品，表面張力會(huì)降低，常見(jiàn)于蛋白純化的流程。

例如在進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析或質(zhì)譜分析時(shí)，樣品需經(jīng)過(guò)脫鹽處理，這樣的樣品在進(jìn)行濃度測(cè)量時(shí)，并不容易形成液柱。

03

表面活性劑

蛋白提取過(guò)程中經(jīng)常使用的表面活性劑（清潔劑），如SDS、Triton X100，會(huì)大幅降低樣品的表面張力，這些物質(zhì)常會(huì)殘留在樣本中，難以完全去除。

尤其一些非離子型表面活性劑對(duì)蛋白質(zhì)在界面吸附性的影響更加值得考慮。

04

固液接觸表面

當(dāng)使用移液器將微量樣品加載到點(diǎn)樣臺(tái)后，會(huì)出現(xiàn)液體與固體的接觸表面，點(diǎn)樣臺(tái)表面的親水/疏水性質(zhì)會(huì)影響液體的表面張力。

因此，使用拉伸法的主流品牌微量分光光度計(jì)，點(diǎn)樣臺(tái)表面具有疏水性涂層，會(huì)增大液體的張力。

微量水分測(cè)定儀測(cè)量的重復(fù)性差可能的原因有:

1.樣品不均勻。例如它們有不同的成分。樣品越不平均則需要更多的樣品來(lái)獲得較好重復(fù)性的結(jié)果。

2.選擇的干燥時(shí)間太短。延長(zhǎng)干燥時(shí)間或選擇合適的關(guān)閉模式“每單位時(shí)間的重量喪失”。

3.樣品沒(méi)有完全干燥(例如:由于表面結(jié)皮)。嘗試混合石英沙進(jìn)行干燥。

4.選擇的溫度太高或樣品氧化。降低干燥溫度。

5.樣品沸騰并不斷飛濺從而改變溫度。請(qǐng)清洗保護(hù)玻璃。

6.當(dāng)保護(hù)玻璃污蝕時(shí)，加熱量不能完全發(fā)揮,請(qǐng)清潔保護(hù)玻璃。

7.溫度傳感器被污染或損壞。請(qǐng)清洗溫度傳感器。

8.操作臺(tái)不穩(wěn)固。請(qǐng)應(yīng)用穩(wěn)固的操作臺(tái)。

9.外部環(huán)境不穩(wěn)定(振動(dòng)等)。

液相色譜儀峰面積重復(fù)性不佳是什么原因